文 洁,朱根福

轻微中枢神经细胞损伤大多由于外伤,如车祸、体育运动等造成,表现为轻度脑、脊髓挫伤并伴随不同程度的细胞变性和凋亡,影响病人的认知功能和运动协调能力[1-3]。神经细胞是中枢神经系统的基本结构和功能单位之一,作为高度极化的终末分化细胞,神经细胞再生能力较差,一旦受到损伤,很难得到修复和补充,因此,临床上治疗中枢神经细胞损伤的手段非常有限[4]。归根汤名源于《道德经》“归根曰静”之意,药方来源于《三因极一病证方论》中的人参养荣汤,是治疗失眠抑郁、温阳补肾的中药方剂。本研究观察归根汤对轻微脑中枢神经损伤大鼠的干预,检测大鼠海马组织细胞凋亡情况,研究其对抑制中枢神经细胞模型大鼠海马组织损伤及相关蛋白和基因表达水平的影响,以期为归根汤在治疗轻微中枢神经细胞损伤方面提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验药物、试剂及仪器

归根汤药方组方:黄芪、肉桂、白芍、当归、党参、白术、干姜、远志、川芎、炙甘草、生龙齿;微晶纤维素(广州天盛化工有限公司,货号2020-1);枸橼酸三乙酯(阿拉丁生化科技股份有限公司,批号T106153);玉米淀粉(山东蕴涵精细化工有限公司,批号05612);纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司);EUDRAGIT L30D-55(上海昌为医药辅料技术有限公司);海藻酸钠(阿拉丁生化科技股份有限公司,批号S100128);硬脂酸镁(阿拉丁生化科技股份有限公司,批号M110510)。流式细胞术双染色凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit,CA1020-20T,Solarbio)。流式分析仪器(BD Calibur,美国BD公司);甲醇(色谱纯,北京化学试剂公司)。

1.2 动物造模与分组、给药

健康无特定病原体(SPF)级Sprague Dawley(SD)大鼠30只,6周龄,体质量120～150 g,购自北京维通利华实验动物有限公司,合格证号:SCXK(京)2012-0001;实验设计和对动物的处置方法符合3R原则[5],并经过广州中医药大学实验动物管理委员会批准。大鼠随机分为空白对照组、损伤模型组和归根汤组,每组10只。轻微脑损伤模型参考文献[6]方法制备。空白对照组大鼠则不做任何处理。造模结束后空白对照组和损伤模型组大鼠给予同等剂量生理盐水,归根汤组给予中药汤剂归根汤,按每千克体质量大鼠的给药量为人的6.3倍计算,每天灌胃1次,共给药2周。

1.3 标本与检测指标

标本取样及样品处理:给药结束后,麻醉并安乐死所有大鼠,手术取出大鼠大脑组织。每组随机选取5只大鼠的脑组织进行裂解,获得单细胞悬液。麻醉药物采用1.2%的Avertin溶液,腹腔注射0.2 mL/10 g体质量。大鼠安乐死采用二氧化碳窒息法。流式分析:所得单细胞悬液通过Annexin V/PI双染色法进行流式分析,获得造模前后、给药前后组织凋亡细胞的情况。逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析每组剩余5只大鼠,分离海马组织并于-80 ℃冷冻保存用于通过qRT-PCR分析细胞自噬相关基因表达水平的变化。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 双染色法检测大鼠海马组织细胞凋亡情况

细胞坏死与空白对照组比较,损伤模型组大鼠的大脑海马组织细胞凋亡数量增加,由(0.418±0.019)%增加到(0.809±0.009)%,提示模型建立后大鼠的海马组织受到了一定的损伤,初步判断建模成功。归根汤组给药后,与损伤模型组比较,细胞坏死数量降低到(0.611±0.014)%,差异有统计学意义(P<0.05)。无论是早、晚期的细胞凋亡,还是活细胞总数,经过归根汤治疗后的动物模型都有恢复到正常水平的趋势。详见图1、表1。

表1 双染色法检测大鼠海马组织细胞凋亡情况 单位:%

图1 流式Annexin V/PI双染色法检测大鼠海马组织细胞凋亡情况

2.2 大鼠海马组织自噬蛋白表达变化

与损伤模型组比较,归根汤组大鼠的海马组织相关蛋白表达水平变化,其中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号蛋白降低,差异有统计学意义(P<0.05);而自噬标志物(LC3)和自噬相关蛋白(Beclin)蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。归根汤给药后细胞自噬能力得到提高,这对组织细胞修复具有重要意义。详见表2。

表2 各组大鼠海马组织相关蛋白表达阳性指数比较

2.3 qRT-PCR检测大鼠海马组织自噬相关基因的mRNA表达水平

为了进一步评估大鼠海马组织自噬水平变化,通过qRT-PCR检测自噬相关基因的mRNA表达水平的变化,与损伤模型组比较,归根汤组的LC3和Beclin基因相对表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),mTOR基因相对表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。详见图2。

3 讨 论

中枢神经系统损伤后,神经细胞之间的联系被破坏,导致细胞变性和死亡,损伤的轴突周围的外源性生长抑制因子阻止细胞再生[6-7]。轴突损伤是一种急性神经元应激,可触发轴突和细胞体的剧烈反应,包括钙内流、轴突膜封闭、损伤信号转导和转录改变[8]。中枢神经的再生能力较低,受到损伤时,神经功能较难恢复。现西医治疗多应用外源性神经营养因子,虽然可促进轴突的再生和神经功能的恢复,但存在半衰期短、不能透过血脑屏障等问题[9]。

中医学认为,肾主志,生髓通于脑。轻微神经损伤,肾精不足,则不能生发气血润养肌肉而认知功能降低。归根汤药方组成为黄芪、肉桂、白芍、当归、党参、白术、干姜、远志、川芎、炙甘草、生龙齿。方中黄芪大补元气,肉桂引诸药入心,远志能通肾气上达于心,全方补肾益精生髓,促进神经系统损伤修复。为了研究归根汤对治疗中枢神经细胞损伤的潜在价值,评估其抑制神经细胞损伤、凋亡的情况,本研究对轻微脑中枢神经损伤模型的大鼠使用归根汤干预,发现归根汤可以有效抑制大鼠海马组织细胞凋亡。

轻微大脑神经损伤常伴随着海马组织细胞的坏死和凋亡,有研究报道机体的细胞自噬可以通过胞内成分的降解、病原体的清除阻止细胞进一步损伤[10],无论是阿尔茨海默病动物模型还是阿尔茨海默病病人,其脑组织自噬功能均存在障碍[11]。自噬是机体自身严格调控的过程,是细胞应激反应的核心组成部分[12]。它通过自噬体-溶酶体途径降解功能失调的蛋白质、脂质和细胞器,在维持细胞内稳态中发挥保守作用[13]。近期报道显示,自噬在损伤后轴突再生中发挥重要作用,LC3在急性脊髓损伤后表达上调[14],LC3是自噬小体形成的关键,也是自噬的标志。使用自噬诱导肽激活自噬可以通过限制神经生长相关蛋白SCG10促进轴突再生[15]。mTOR信号通路可调节细胞增殖、生存、蛋白质合成、自噬和细胞代谢。此外,有报道称mTOR可影响整个中枢神经系统损伤神经的再生,mTOR作为自噬的负调控因子之一,在激活自噬中具有门控作用[16]。另外,mTOR信号通路在归根汤组的小鼠模型中明显下调,这可能是因为归根汤是通过mTOR信号通路起作用的,即通过下调mTOR促进神经细胞自噬的上调,从而起到较好的组织细胞损伤的作用效果。

Bcl-2同源结构域蛋白抗体(Beclin 1)是自噬信号通路中重要的因子,参与缺氧缺血诱导的自噬发生,干扰Beclin1表达能够降低缺氧缺血诱导的自噬[17]。因此,通过检测分析自噬相关蛋白的水平,可以有效地评估神经损伤的程度。研究报道,以温阳补肾方剂可增加大鼠血浆和脑组织中的促红细胞生成素(EPO)表达,从而降低大鼠大脑组织细胞的凋亡[18]。归根汤坚阳道而补肾气可益精健脑,对于治疗中枢神经损伤有一定的潜力。在本研究中,归根汤组大鼠的大脑海马组织细胞损伤数目明显减少,活细胞与空白对照组比较差异无统计学意义,与损伤模型组大鼠比较,归根汤组mTOR信号蛋白降低,LC3和Beclin蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05),提示归根汤对海马组织损伤有较好的抑制作用。

药物制剂能否抑制细胞凋亡是验证其能否抑制神经细胞损伤的重要影响因素之一[7,19]。细胞凋亡是细胞的基本特征之一,在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面都起到十分重要的作用。FITC-Annexin V 与PI 匹配使用,可以有效分析给药前后细胞的坏死、早期和晚期细胞凋亡。本实验对比了正常大鼠、损伤模型大鼠及归根汤治疗后的损伤模型大鼠的海马组织,结果发现,归根汤治疗后的海马组织细胞坏死、细胞早晚期凋亡与空白对照组差异有统计学意义,而损伤大鼠模型组海马组织细胞凋亡明显,细胞坏死增加,一定程度说明归根汤对抑制神经细胞损伤具有重要的潜力。

归根汤可降低神经损伤模型大鼠的海马组织细胞损伤程度,其作用机制有可能是通过下调mTOR信号通路,促进损伤细胞的自噬而抑制神经细胞损伤实现的。