尉建辉,刘虎军

脑卒中是具有高致残率、致死率的常见脑血管疾病,其中缺血性脑卒中占70%[1]。临床采用物理或药物溶栓、恢复血流供应的方式治疗缺血性脑卒中,但此过程常引发脑缺血/再灌注损伤(CI/RI)。缺血/再灌注损伤发病机制复杂,其中神经细胞氧化应激损伤、细胞凋亡是导致缺血/再灌注损伤的重要原因[2]。因此,抑制神经细胞氧化应激损伤及凋亡有利于减轻缺血/再灌注损伤。桑白皮为桑科植物Morus alba L.的干燥根皮,富含多糖、黄酮类化合物、类固醇、挥发油等多种成分,可泻肺平喘、利水消肿[3]。研究显示,桑白皮多糖可抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡、氧化应激,保护心肌细胞免受氧化损伤,其作用机制与调控circDLGAP4/miR-320轴有关[4]。但还少见桑白皮多糖影响脑缺血/再灌注引起的神经细胞损伤的相关报道。微小RNA(miR)-122是一种在缺血/再灌注损伤大鼠脑组织、缺血再灌注诱导的神经细胞中均表达增加的微小RNA,下调miR-122可通过促进DJ-1基因表达及增强磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路活性抑制神经细胞凋亡,miR-122可作为减轻缺血/再灌注损伤的分子靶点[5]。本研究建立氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)诱导PC12细胞损伤模拟缺血/再灌注损伤,主要探究桑白皮多糖对缺血/再灌注损伤过程中细胞氧化损伤、凋亡的影响及其能否通过调控miR-122发挥作用,以期为缺血/再灌注损伤治疗提供新途径。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

PC12细胞购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司(批号:20190203);桑白皮多糖购自上海益本生物医药科技有限公司(纯度:≥98%,批号:20190408);胎牛血清(FBS)购自浙江天杭生物科技股份有限公司(批号:20190511);乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号:20181203,20181118,20181223);DMEM培养液、LipofectamineTM2000试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡试剂盒,北京索莱宝科技有限公司(批号:20190107,20190121,20190123);一抗[活化的半胱天冬酶(Cleaved-Caspase)-3、Cleaved-Caspase-9、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)]、山羊抗兔二抗购自英国Abcam公司(批号:20180911,20181224,20181217);逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)实验相关试剂盒购自大连宝生物(批号:20190214);引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成;转染物均购自广州锐博生物。StepOnePlus的qRT-PCR仪购自美国Applied Biosystems公司;FACS Calibur流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特;电泳仪购自北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和OGD/R处理

用完全培养液(含10% FBS的DMEM培养液)于二氧化碳培养箱(37 ℃、5%二氧化碳、95%空气)中培养PC12细胞。参照文献[6]方法建立OGD/R模型:先用无糖无血清DMEM培养液于缺氧培养箱(37 ℃、5%二氧化碳、95% N2)培养2 h,再换为完全培养液于二氧化碳培养箱中培养12 h。

1.2.2 细胞分组

于6孔板中(1.0×105个/孔)常规培养PC12细胞12 h后,分为对照(Control)组、OGD/R组、OGD/R+桑白皮多糖低剂量组、OGD/R+桑白皮多糖中剂量组、OGD/R+桑白皮多糖高剂量组。OGD/R+桑白皮多糖低剂量组、OGD/R+桑白皮多糖中剂量组、OGD/R+桑白皮多糖高剂量组分别用含0.1、0.2、0.4 μg/mL桑白皮多糖的培养液于二氧化碳培养箱中培养24 h[4],再建立OGD/R模型;OGD/R组用不含桑白皮多糖的培养液于二氧化碳培养箱中培养24 h,再建立OGD/R模型;Control组用不含桑白皮多糖的培养液于二氧化碳培养箱中培养38 h。各组培养结束后,收集细胞培养上清液、细胞,分别进行指标检测。

1.2.3 比色法检测LDH漏出率、MDA含量、SOD活性

将收集的上清液350 r/min离心10 min,取上清10 mL,利用LDH试剂盒检测上清液中LDH水平,LDH漏出率(%)=(LDH实验组-LDH对照组)/LDH对照组×100%。裂解收集细胞,350 r/min离心10 min,取上清液,分别利用MDA、SOD试剂盒检测上清中MDA含量、SOD活性。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率

采用磷酸缓冲盐溶液(PBS)对收集细胞清洗,300 r/min离心5 min,弃上清液。加Binding Buffer重悬细胞,至密度为1.0×106个/mL。取100 μL细胞悬液,利用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡。

1.2.5 蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测蛋白表达

用RIPA试剂裂解收集细胞对总蛋白进行提取,二喹啉甲酸法(BCA)检测蛋白浓度。SDS-PAGE实验对总蛋白进行分离,转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,并于5 %脱脂奶粉中封闭2 h。于4 ℃冰箱中分别用cleaved-Caspase-3(1∶500)、Cleaved-Caspase-9(1∶500)、GAPDH(1∶1 000)一抗孵育12 h,洗膜。室温下,用山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育2 h。滴加显影液显影,曝光拍照,Image J软件分析条带灰度值,以Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9与GAPDH灰度值的比值表示其相对表达量。

1.2.6 qRT-PCR法检测miR-122表达

利用miRNA提取试剂盒对细胞中总RNA提取,逆转录为cDNA后,行PCR扩增。引物序列:miR-122正向5′-CGTGGAGTGTGACAATGGTGTT-3′,反向5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′;U6正向5′-CTCGCT TCGGCAGCACA-3′,反向5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。2-△△Ct法计算miR-122相对U6的表达量。

1.2.7 细胞转染与处理

于6孔板中(1.0×105个/孔)培养PC12细胞24 h,利用LipofectamineTM2000试剂盒分别转染anti-miR-122、anti-miR-NC、miR-122 mimics、miR-NC,转染12 h,qRT-PCR法检测miR-122表达验证转染效果。转染anti-miR-122、anti-miR-NC的PC12细胞接种至6孔板中,均按照OGD/R组处理,分别记为OGD/R+anti-miR-122组、OGD/R+anti-miR-NC组;转染miR-122 mimics、miR-NC的PC12细胞接种至6孔板中,均按照OGD/R+桑白皮多糖高剂量组处理,分别记为OGD/R+桑白皮多糖+miR-122组、OGD/R+桑白皮多糖+miR-NC组。按照上述试验步骤分别检测各组氧化应激指标(LDH、MDA、SOD)、细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白表达量。每组实验设置3个复孔,实验重复3次。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 桑白皮多糖对OGD/R诱导的PC12细胞氧化损伤的影响

OGD/R组LDH漏出率、MDA含量高于Control组(P<0.05),SOD活性低于Control组(P<0.05);OGD/R+桑白皮多糖低剂量组、OGD/R+桑白皮多糖中剂量组、OGD/R+桑白皮多糖高剂量组LDH漏出率、MDA含量低于OGD/R组(P<0.05),SOD活性高于OGD/R组(P<0.05),且各检测指标在OGD/R+桑白皮多糖低剂量组、OGD/R+桑白皮多糖中剂量组、OGD/R+桑白皮多糖高剂量组组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 桑白皮多糖对OGD/R诱导的PC12细胞氧化损伤的影响

2.2 桑白皮多糖对OGD/R诱导PC12细胞凋亡的影响

OGD/R组凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白表达量高于Control组(P<0.05);OGD/R+桑白皮多糖低剂量组、OGD/R+桑白皮多糖中剂量组、OGD/R+桑白皮多糖高剂量组凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白表达量低于OGD/R组(P<0.05),且各检测指标在OGD/R+桑白皮多糖低剂量组、OGD/R+桑白皮多糖中剂量组、OGD/R+桑白皮多糖高剂量组组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图1、表2。

图1 桑白皮多糖对OGD/R诱导的PC12细胞凋亡的影响

表2 桑白皮多糖对OGD/R诱导的PC12细胞凋亡的影响比较

2.3 桑白皮多糖对OGD/R诱导的PC12细胞miR-122表达的影响

OGD/R组miR-122表达量高于Control组(P<0.05);OGD/R+桑白皮多糖低剂量组、OGD/R+桑白皮多糖中剂量组、OGD/R+桑白皮多糖高剂量组miR-122表达量低于OGD/R组(P<0.05),且miR-122表达量在OGD/R+桑白皮多糖低剂量组、OGD/R+桑白皮多糖中剂量组、OGD/R+桑白皮多糖高剂量组组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 桑白皮多糖对OGD/R诱导的PC12细胞miR-122表达的影响

2.4 干扰miR-122表达对OGD/R诱导的PC12细胞损伤的影响

miR-122在转染anti-miR-122的PC12细胞中的表达量为(0.25±0.02),低于转染anti-miR-NC的细胞(1.00±0.00),差异有统计学意义(t=-112.500,P<0.05),说明转染anti-miR-122的PC12细胞中miR-122表达受到干扰。OGD/R+anti-miR-122组LDH漏出率、MDA含量、凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白表达量均低于OGD/R+anti-miR-NC组(P<0.05),SOD活性高于OGD/R+anti-miR-NC组(P<0.05)。详见图2、表4。

图2 干扰miR-122表达对OGD/R诱导的PC12细胞凋亡的影响

表4 干扰miR-122表达对OGD/R诱导的PC12细胞损伤影响的比较

2.5 上调miR-122表达逆转桑白皮多糖对OGD/R诱导的PC12细胞损伤的作用

miR-122在转染miR-122 mimics的PC12细胞中的表达量为(2.85±0.22),高于转染miR-NC的细胞(1.00±0.00),差异有统计学意义(t=25.227,P<0.05),说明转染miR-122 mimics的PC12细胞中miR-122表达上调。OGD/R+桑白皮多糖+miR-122组LDH漏出率、MDA含量、凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白表达量均高于OGD/R+桑白皮多糖+miR-NC组(P<0.05),SOD活性低于OGD/R+桑白皮多糖+miR-NC组(P<0.05)。详见图3、表5。

表5 上调miR-122表达逆转桑白皮多糖对OGD/R诱导的PC12细胞损伤的作用比较

3 讨 论

近年来,由于工作、生活压力增加,缺血性脑卒中发病率不断增长,且呈年轻化趋势[7]。脑缺血发生后,血流中断,治疗以恢复血流供应为主。但再灌注时,脑组织产生大量活性氧,造成过氧化氢、超氧自由基、氢自由基增多,导致蛋白质、脂质氧化,神经细胞受损[8]。LDH是一种表达于细胞胞质的糖酵解酶,在细胞受损后被释放,因此,细胞培养上清液中LDH漏出率可间接反映细胞受损程度。MDA是脂质过氧化产物,也是反映细胞氧化损伤的重要指标。活性氧增加导致抗氧化平衡被破坏,抗氧化酶如SOD活性降低。过度的氧化损伤可进一步引起神经细胞凋亡,加剧缺血/再灌注损伤。大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞高度分化后,具有神经细胞特性,常用OGD/R诱导PC12细胞损伤模拟缺血/再灌注损伤[9]。本实验结果显示,PC12细胞经OGD/R诱导后,LDH漏出率、MDA含量均增加,而SOD活性降低,且细胞凋亡率增加,提示OGD/R诱导的PC12细胞损伤模型建立成功。

目前,缺血/再灌注损伤发病机制复杂,缺乏有效的治疗药物。中药或其活性成分毒性低、作用靶点多,且疗效强,是疾病治疗药物研究的重点。桑白皮多糖是中药桑白皮的主要活性成分,具有抗氧化、调节免疫等药理活性[10]。Zhao等[11]报道,桑白皮多糖可通过激活核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件(Nrf2/ARE)信号通路、促进过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性保护肝细胞免受棕榈酸诱导的氧化损伤和脂毒性,改善脂质代谢紊乱。本实验结果显示,桑白皮多糖可降低OGD/R诱导的PC12细胞氧化损伤,并减少细胞凋亡,且呈剂量依赖性,提示其具有减轻缺血/再灌注损伤的潜在价值。Caspase-9和Caspase-3是Caspase级联反应的重要参与者,其被活化后传递凋亡信号或诱导细胞凋亡[12]。本实验数据提示,桑白皮多糖可能通过间接抑制Caspase级联反应减少OGD/R诱导的PC12细胞凋亡,且呈剂量依赖性,可能有助于缺血性脑卒中的治疗。

miRNA是一类小分子非编码RNA,研究已表明,多种miRNA如miR-193b-3p[13]、miR-381-3p[14]、miR-455[15]在脑缺血再灌注脑组织或OGD/R诱导的神经细胞中异常表达,参与调控OGD/R诱导的神经细胞凋亡、炎症反应或氧化应激,为减轻缺血/再灌注损伤提供了潜在分子靶点。作为一种miRNA,miR-122的异常表达与多种疾病的发生发展有关。研究显示,miR-122是放射性脑损伤(RBI)小鼠脑组织中表达上调的miRNA,敲减miR-122可有效改善RBI小鼠认知障碍,减轻神经元损伤和神经炎症[16];miR-122在脂多糖(LPS)诱导的大鼠心肌细胞H9c2中表达增加,敲减miR-122通过靶向G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(GIT1)抑制LPS诱导的H9c2细胞炎症、氧化应激及细胞凋亡,有利于减轻脓毒症引发的心肌损伤[17];miR-122在LPS诱导的肾小管上皮细胞中表达上调,敲减miR-122可保护肾小管上皮细胞免受LPS损伤,miR-122是治疗脓毒症引起的急性肾损伤的潜在分子靶点[18]。

本实验数据显示,miR-122在OGD/R诱导的神经细胞PC12中表达增加,干扰miR-122表达减轻OGD/R诱导的PC12细胞氧化损伤,并减少细胞凋亡,这与上述研究结果一致[16-18],提示miR-122也可作为治疗缺血/再灌注损伤的分子靶点。Meng等[19]研究显示,灰树花多糖可减轻脂多糖/d-半乳糖胺(LPS/d-GalN)诱导的小鼠肝组织炎症损伤及氧化应激损伤,这与其下调肝组织中miR-122表达进而激活Nrf2/ARE信号通路有关。本实验结果表明,桑白皮多糖可呈剂量依赖性抑制OGD/R诱导的神经细胞PC12中miR-122表达,而上调miR-122可逆转桑白皮多糖对OGD/R诱导的PC12细胞氧化应激、细胞凋亡的影响,提示桑白皮多糖可能通过下调miR-122减轻缺血/再灌注损伤,但其具体作用的miR-122靶基因和下游信号通路有待进一步探究。

综上所述,桑白皮多糖对OGD/R诱导的PC12细胞氧化应激、细胞凋亡具有显著抑制作用,其作用机制可能与下调miR-122表达有关,提示其可减轻缺血/再灌注损伤,有助于缺血性脑卒中的治疗,但尚需进一步在体内探究。