韩思梁,赵泽群,石 云,孔繁昌

心肌肥大是一种强有力的代偿形式,如果代偿形式时间持续延长或者强度无限增大,则肥大心肌在一定疾病程度上可转向心力衰竭,危害生命健康[1-2]。环氧化酶2(COX2)/前列腺素E2(PGE2)途径可以调控多种疾病的发生和发展,抑制该信号通路可延缓某些疾病的进展[3-4]。川芎嗪对心脏有抑制心肌收缩的作用,对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用[5-6]。但川芎嗪对心肌肥大的影响及其可能作用机制尚未明确。本实验探究川芎嗪通过抑制COX2/PGE2途径减轻血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌肥大。

1 材料与方法

1.1 实验材料

小鼠心肌细胞H9c2系购自中国科学院上海细胞生物研究所;DMEM培养基、磷酸缓冲盐溶液(PBS)购自美国Hycolne公司;AngⅡ购自上海源叶生物技术有限公司;甲基噻唑基四唑(MTT)试剂购自上海碧云天生物技术研究所;钙离子荧光探针Fluo-3/AM购自北京博奥森生物技术有限公司;采用比色法测定细胞一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS),试剂盒以及酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所;反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)试剂盒购自大连宝生物科技有限公司;二喹啉甲酸法(BCA)试剂盒购自北京Apuris生物技术有限公司。

1.2 药物

川芎嗪购自无锡市第七制药有限公司(规格:40 mg/2 mL;纯度:≥98%),批号06032411。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养、分组

H9c2细胞用含10% FBS的DMEM培养基培养,细胞融合80%～90%时,进行传代培养,收集细胞用于后续实验。培养小鼠正常心肌细胞H9c2作为对照组;用0.1 μmol/L的AngⅡ诱导建立H9c2肥大模型作为模型组。用低剂量(0.01 mmol/L)、中剂量(0.1 mmol/L)、高剂量(1 mmol/L)的川芎嗪干预AngⅡ诱导的H9c2细胞作为低剂量川芎嗪组、中剂量川芎嗪组、高剂量川芎嗪组。

1.3.2 MTT法检测细胞的活性

收集各组细胞,接种于96孔板(每孔100 μL),每组设置3个复孔,培养24 h,每孔加20 μL MTT溶液,继续培养4 h,每孔加150 μL二甲基亚砜(DMSO),应用酶标仪检测各孔相对吸光度值(OD=450 nm),计算细胞活性。

1.3.3 Leica Qwin V3图像分析系统测量细胞表面积

收集各组细胞,以5×108个/L接种于6孔板中,培养48 h后,进行苏木精-伊红(HE)染色,Leica Qwin V3图像分析系统测量细胞表面积。

1.3.4 激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子荧光强度[Ca2+]i

收集各组细胞,以1×108个/L接种于Petri皿中,培养48 h后,加入5 μmol/L的钙离子荧光探针Fluo-3/AM,45～60 min后分析细胞[Ca2+]i。

1.3.5 比色法测定细胞NO含量和NOS活性

收集各组细胞,采用比色法测定细胞NO含量和NOS活性,实验步骤严格按照试剂盒的说明逐步进行。

1.3.6 ELISA法测定细胞的细胞转化生长因子β1(TGF-β1)含量

收集各组细胞,采用ELISA法检测细胞中TGF-β1含量,实验过程按照试剂盒说明书进行。

1.3.7 qRT-PCR检测细胞COX2和PGE2 mRNA表达

收集各组细胞,提取细胞的总RNA,将RNA合成cDNA,进行qRT-PCR,循环条件为95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s;72 ℃ 30 s,共40个循环;60 ℃延长5 min。相对表达量用2-△△Ct法计算。

1.3.8 蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测细胞COX2、PGE2蛋白表达

各组细胞提取蛋白浓度,BCA试剂盒测定蛋白浓度,行SDS-PAGE电泳后转至二氨基联苯胺(PVDF)膜上,分别加入一抗(1∶1 000稀释),4 ℃孵育过夜,加入二抗(1∶2 000稀释),室温孵育90 min,用增强型化学(ECL)发光液显影,Quantity One凝胶分析蛋白条带的灰度值。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 川芎嗪对AngⅡ诱导的H9c2细胞活性的影响

与对照组比较,模型组细胞活性下降(P<0.05);与模型组比较,各剂量川芎嗪组细胞活性升高(P<0.05)。详见表1。

表1 川芎嗪对AngⅡ诱导的H9c2细胞活性的影响

2.2 川芎嗪对AngⅡ诱导的H9c2细胞表面积和[Ca2+]i的影响

与对照组比较,模型组细胞表面积和[Ca2+]i升高(P<0.05);与模型组比较,各剂量川芎嗪组细胞表面积和[Ca2+]i降低(P<0.05)。详见表2。

表2 川芎嗪对AngⅡ诱导的H9c2细胞表面积和[Ca2+]i的影响

2.3 川芎嗪对AngⅡ诱导的H9c2细胞NO含量和NOS活性的影响

与对照组比较,模型组细胞NO含量和NOS活性降低(P<0.05);与模型组比较,各剂量川芎嗪组细胞NO含量和NOS活性升高(P<0.05)。详见表3。

表3 川芎嗪对AngⅡ诱导的H9c2细胞NO含量和NOS活性的影响

2.4 川芎嗪对AngⅡ诱导的H9c2细胞TGF-β1含量影响

与对照组比较,模型组细胞TGF-β1含量升高(P<0.05);与模型组比较,低、中、高剂量川芎嗪组细胞TGF-β1含量降低(P<0.05)。详见表4。

表4 川芎嗪对AngⅡ诱导的H9c2细胞TGF-β1含量的影响

2.5 川芎嗪对AngⅡ诱导的H9c2细胞COX2和PGE2 mRNA表达的影响

与对照组比较,模型组细胞COX2和PGE2 mRNA表达升高(P<0.05);与模型组比较,各剂量川芎嗪组细胞COX2和PGE2 mRNA表达降低(P<0.05)。详见表5。

表5 川芎嗪对AngⅡ诱导的H9c2细胞COX2和PGE2 mRNA表达的影响

2.6 川芎嗪对AngⅡ诱导的H9c2细胞COX2和PGE2蛋白表达的影响

与对照组比较,模型组细胞COX2和PGE2蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,川芎嗪各剂量组细胞COX2和PGE2蛋白表达降低(P<0.05)。详见图1、表6。

图1 川芎嗪对AngⅡ诱导的H9c2细胞COX2/PGE2途径相关蛋白表达的影响

表6 川芎嗪对AngⅡ诱导的H9c2细胞COX2和PGE2途径相关蛋白表达的影响

3 讨 论

心肌肥大常见于各种原发或继发的心肌病,是一种不平衡的生长形式。心肌肥大发展到一定程度,可能出现心力衰竭,严重威胁生命安全[7-8]。有研究报道,川芎嗪对于治疗心脏疾病具有显著的疗效[9]。

本研究表明,AngⅡ诱导的心肌细胞活性降低,而川芎嗪处理后细胞活性升高,与既往研究报道结果相似[10]。黄芪甲苷通过激活Sirt3抑制Ang Ⅱ诱导的心肌肥大细胞的活性[11]。本实验研究表明,AngⅡ诱导的心肌细胞表面积和[Ca2+]i显著升高,与既往研究报道结果相似[12],而川芎嗪处理后细胞表面积和[Ca2+]i降低,提示川芎嗪可促进AngⅡ诱导的心肌细胞增殖及改善心肌肥大。

小檗碱可抑制AngⅡ诱导的心肌纤维化,改善心室重塑,其作用与促进心肌成纤维细胞分泌NO、减少TGF-β1含量有关[13]。本实验研究结果,AngⅡ诱导的心肌细胞NO含量和NOS活性降低,TGF-β1的含量升高,而川芎嗪可提高NO含量及增强NOS活性,并可降低TGF-β1的含量。提示川芎嗪可通过抑制TGF-β1表达及提高NO含量、增强NOS活性从而改善心肌肥大。COX2/PGE2途径在机体生理过程中发挥极其重要的信号调控作用,参与了众多疾病的发生与发展[14-15]。本研究结果显示,AngⅡ诱导的心肌细胞中COX2和PGE2的表达量升高,而川芎嗪能够以浓度依赖性方式降低COX2和PGE2的表达。川芎嗪通过抑制COX2/PGE2途径减轻AngⅡ诱导的心肌肥大。