骆奋强

基于铁酸钴纳米颗粒-鲁米诺-H2O2化学发光体系的单宁酸超灵敏检测

骆奋强1,2

（1.漳州职业技术学院 漳州市食品产业技术研究院，福建 漳州 363000；2.漳州职业技术学院 石油化工学院，福建 漳州 363000）

利用铁酸钴纳米颗粒（CoFe2O4NPs）催化鲁米诺-H2O2的化学发光，结合单宁酸会抑制CoFe2O4NPs的催化活性这一性质，首次建立一种简单、快速且超灵敏的单宁酸检测方法。在最佳实验条件下，CoFe2O4NPs-鲁米诺-H2O2体系对单宁酸的检测线性范围为5.0×10-9～5.0×10-7mol/L，检测限为2.5×10-10mol/L。对比其他检测方法，该检测限极低，而且该检测体系选择性良好，有望将该方法运用于食品及水样中单宁酸的检测。

铁酸钴；纳米颗粒；催化；化学发光；单宁酸

单宁酸又称鞣酸，是一种天然酚类化合物，其主要特点是水溶性好，且容易与水溶性蛋白质形成沉淀。单宁酸含有多酚羟基的结构，能与多种金属离子发生络合和静电作用，具有还原性和消除自由基的活性，在食品、医药、皮革和化工等领域有着广泛的应用[1]。工业废水中常常含有单宁酸，而单宁酸又是难降解有机物之一，对水体和土壤造成一定的环境污染。同时，生活中常见的食品如茶叶、未成熟的柿子、香蕉中都含有单宁酸，单宁酸在胃酸环境中与膳食纤维和蛋白质融合，刺激胃粘膜，阻碍人体对铁的吸收，出现腹痛、便秘、胃痛、恶心和呕吐等症状，它是浓茶伤身的最主要物质。因此，寻找一种高灵敏和选择性好的单宁酸检测方法，对于食品分析，生物学、药物分析和环境研究等是很有必要的。

目前，单宁酸的检测方法主要有分光光度法[2]、比色法[3-4]、滴定法[5]、高效液相色谱法[6]、电化学法[7]、蛋白质预沉淀法[8]、荧光分析法[9-12]等，但这些方法都存在相应的不足，前3种方法灵敏度低、选择性较差，后几种方法操作复杂而且需要昂贵的实验仪器，因此，寻找一种灵敏度高、简单快速的单宁酸检测方法具有重要意义。

化学发光（ChemiLuminescence，CL）是物质在进行化学反应过程中伴随的一种光辐射现象，物质分子由于吸收了反应产生的化学能而被激发，发生能级跃迁，产生电子激发态不稳定的中间体，当其从激发态返回基态过程中可以发射出一定波长的光。化学发光分析方法具有灵敏度高、仪器简单、分析快速、容易与其他技术相结合的特点，在很长一段时间内展露其广泛良好的应用价值[13]。SHI等[14]将铁酸钴纳米粒子（CoFe2O4nanoparticles，CoFe2O4NPs）作为过氧化物模拟酶应用于鲁米诺-H2O2发光体系并用来检测过氧化氢和葡萄糖，而利用CoFe2O4NPs化学发光检测单宁酸的研究还未见报道。因此，利用单宁酸抑制CoFe2O4NPs的催化活性与CoFe2O4NPs催化鲁米诺-H2O2产生化学发光这两种现象，可以开发一种简单、快速且超灵敏的单宁酸化学发光检测方法。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

鲁米诺（C8H7N3O2），分析纯，Alfa Aesar公司；单宁酸（C76H52O46），分析纯，阿拉丁试剂公司；甘氨酸（C2H5NO2），分析纯，阿拉丁试剂公司；其他化学试剂均为分析纯以上级别，实验用水为二次蒸馏水。

SCIENTIFIC SOVALL LEGEND MICRO-17R微量台式离心机，德国Thermo公司；Tecnai G2 F20 S-TWIN 200KV型场发射透射电子显微镜（HRTEM），美国FEI公司；MPI-A型电化学发光检测仪，西安瑞迈分析仪器有限公司；Ultima IV型X射线粉末衍射仪（XRD），日本Rigaku；ASAP2020物理吸附仪，麦克默瑞提克仪器有限公司。XRD实验使用Cu靶作为辐射源，扫描范围10°～70°。采用物理吸附仪对样品的比表面和孔径进行测定，样品在473 K温度下脱气预处理5 h，吸附介质为氮气，测试温度为77 K。

1.2 CoFe2O4NPs的合成

将2.4 g甘氨酸溶于5mL去离子水中，然后加入0.808g Fe(NO3)3‧9H2O和0.291g Co(NO3)2‧6H2O，室温搅拌1h后过滤。将红色溶液加热至黑色疏松粉末的状态，置于马弗炉800℃烘烤4～6 h，得到黑色固体。将黑色固体溶于水，悬浮液离心分离后放于真空干燥箱干燥8 h，得到CoFe2O4NPs。

1.3 单宁酸的检测

用移液枪准确移取20.0 μL1.0×10−4mol/L鲁米诺溶液，20.0 μL 2.0 mg/mL CoFe2O4NPs溶液，1950.0 μL pH=9.5磷酸盐缓冲液（PBS）到反应池中，注入10.0μL 2.5×10−3mol/L H2O2，用发光检测仪器检测发光信号I。用移液枪准确移取20.0 μL1.0×10−4mol/L鲁米诺溶液，20.0 μL 2.0 mg/mL CoFe2O4NPs溶液，20.0 μL不同浓度的单宁酸溶液，1930.0 μL pH=9.5 PBS到反应池中，注入10.0 μL2.5×10−3mol/L H2O2，用发光检测仪器检测发光信号I。

选择性考察：用移液枪准确移取20.0 μL1.0×10−4mol/L鲁米诺溶液，20.0 μL 2.0 mg/mL CoFe2O4NPs溶液，1930.0 μL pH=9.5 PBS和20.0 μL不同浓度的单宁酸、乙醇、蔗糖、葡萄糖、酒石酸、维生素C、苯甲酸溶液到反应池中，注入10.0μL2.5×10−3mol/L H2O2，用发光检测仪器检测发光信号。

2 结果与讨论

2.1 CoFe2O4NPs的表征

采用高分辨率的场发射透射电镜分析CoFe2O4NPs的微观结构。如图1所示，该纳米材料呈现疏松多孔的网状结构，存在一定的聚集现象，但分散较为均匀，孔径大小约为2～5nm。

图1 不同比例尺的CoFe2O4NPs的HRTEM

对该物质进行XRD表征，得到图2(a)，结合标准图库中的JCPDS No.22-1086可知，该纳米颗粒是纯相铁酸钴纳米颗粒。图2(b)为依据Brunauer-Emmett-Teller方程计算得到的CoFe2O4NPs吸脱附等温曲线，样品在高相对压力下呈现出V型等温线和可见的H3型滞后环，存在毛细凝结的多层吸附情况，表明所测材料由松散的聚合物片状颗粒形成的狭缝状孔[15]。根据IUPAC的分类，说明CoFe2O4NPs为典型的介孔吸附材料，其比表面积为56.3 cm2/g，表明该材料的比表面积大，可以提供大量的活性反应位点，适合作为催化剂使用。图２(b)中插图是该介孔材料的孔径分布图，图中出现双峰，一个是孔径的大小，另一个是由于复制不完全产生的孔分布，说明该材料的有序性不高，再次验证CoFe2O4NPs属于介孔材料。

图2 CoFe2O4NPs的X射线衍射谱和N2吸脱附曲线

注：(b)插图为相应的孔径分布。

2.2 CoFe2O4NPs催化鲁米诺-H2O2反应现象及机理研究

通过对CoFe2O4NPs-鲁米诺-H2O2体系的化学发光行为研究发现，当有CoFe2O4NPs存在时，鲁米诺-H2O2体系化学发光明显增强。进一步对比有无CoFe2O4NPs存在时的化学发光光谱，图3(a)(b)化学发光体系都只在425nm处有发射峰，而鲁米诺的最大发射光波长就是425nm，这说明了CoFe2O4NPs的加入并没有产生新的发光体，鲁米诺-H2O2化学发光信号的增强是由CoFe2O4NPs的催化作用引起的。

图3 CoFe2O4NPs存在与否条件下鲁米诺-H2O2反应的化学发光响应曲线和化学发光光谱

注：(a) 1.0×10-4mol/L鲁米诺，5.0×10-6mol/L H2O2，0.1 mol/L pH=12.5 PBS； (b) 1.0×10-4mol/L鲁米诺，5.0×10-6mol/L H2O2，30.0μg/mL CoFe2O4NPs，0.1mol/L pH=12.5 PBS。

结合相关文献[14]，推测CoFe2O4NPs催化鲁米诺-H2O2化学发光的反应机理如图4所示，CoFe2O4NPs可以催化H2O2分解产生羟基自由基（反应式(1)），在碱性条件下进而产生超氧自由基（反应式(2)(3)），而鲁米诺在碱性条件下也可以和羟基自由基反应产生鲁米诺自由基（反应式(4)(5)）。最后，鲁米诺自由基与超氧自由基在CoFe2O4NPs的催化作用下反应生成鲁米诺激发态（3-氨基邻苯二甲酸根离子），这一产物在回到基态时以光辐射的形式发出最大波长为425nm的蓝光（反应式(6)(7)）。综上，CoFe2O4NPs对鲁米诺-H2O2化学发光体系的催化作用是相当明显的，结合单宁酸抑制CoFe2O4NPs的催化活性这一性质，可以发展出一种新型的单宁酸检测方法。图5可以直观地表达出CoFe2O4NPs-鲁米诺-H2O2测定单宁酸传感器的检测机理：不含单宁酸时，CoFe2O4NPs催化H2O2产生自由基使得鲁米诺被氧化为激发态，随后产生化学发光；当有单宁酸存在时，单宁酸具有多个邻位酚羟基结构，可与CoFe2O4NPs结合，生成CoFe2O4NPs-单宁酸的结合物，这种结合物对鲁米诺-H2O2体系的催化活性大大降低，会强烈抑制化学发光强度。

图4 CoFe2O4NPs催化鲁米诺-H2O2化学发光可能的机理

图5 CoFe2O4NPs-鲁米诺-H2O2体系检测单宁酸的原理示意图

2.3 CoFe2O4NPs-鲁米诺-H2O2测定单宁酸传感器的建立

在构建CoFe2O4NPs-鲁米诺-H2O2测定单宁酸的传感器之前，需要对传感条件进行优化。重点考察了溶液pH、响应时间、CoFe2O4NPs浓度、H2O2浓度和鲁米诺浓度对传感信号的影响。因为鲁米诺需要在碱性条件才能发光，因此考察该传感体系在pH=9.0～12.0时的发光响应情况，当pH=9.0～9.5时，I/I（I为未加单宁酸的发光强度，I为加入单宁酸的发光强度）迅速增大；当pH=9.5～10.5时，I/I迅速减小，pH大于10.5后，I/I趋于稳定。因此选择pH=9.5为该体系的最佳pH。反应时间考察结果表明，在0.5～8.0 min反应时间内，随着反应时间的延长，I/I逐渐减小，这可能是因为低浓度的单宁酸经过光照的时间越长，分解得越多，与CoFe2O4NPs结合的效果越差，抑制催化的效果越差，所以选择0.5min作为实验的最佳反应时间。根据不同CoFe2O4NPs浓度下体系的化学发光响应结果，发现在5.0～80.0 μg/mL范围内，体系I/I逐渐增大，但是增大的幅度不一样，当CoFe2O4NPs浓度在5.0～20.0μg/mL时，I/I迅速增大，而当CoFe2O4NPs浓度在20.0～80.0 μg/mL时，I/I增大的趋势变缓。可能由于CoFe2O4NPs本身是一种黑色纳米粒子，随着CoFe2O4NPs浓度的增加，溶液自身的颜色变深，发生自吸收现象。从节约材料和提高检测灵敏度的角度综合考虑，CoFe2O4NPs溶液浓度控制在20.0 μg/mL最合适。通过对H2O2浓度和鲁米诺浓度传感条件的考察结果显示，在一定浓度范围内，随着H2O2浓度和鲁米诺浓度的增加，单宁酸抑制鲁米诺化学发光强度现象越不明显，导致I/I逐渐减小，因此，选用的H2O2和鲁米诺浓度分别为1.25×10-5mol/L和1.0×10-6mol/L。最后，构建CoFe2O4NPs-鲁米诺-H2O2测定单宁酸传感器的最优实验条件，如表1所示。

图6 利用CoFe2O4NPs-鲁米诺-H2O2体系检测单宁酸的线性关系

表1 CoFe2O4NPs-鲁米诺-H2O2检测单宁酸传感器的最优实验条件

在最佳测量条件下，对所构建CoFe2O4NPs-鲁米诺-H2O2测定单宁酸的性能进行评价，结果如图6所示，单宁酸浓度在5.0×10-9～5.0×10-7mol/L范围内的lg单宁酸与lg(I/I)呈线性关系，回归方程为=0.9637+8.1946，相关系数2= 0.9905，在信噪比（S/N）为3时，检测限（LOD）为2.5×10-10mol/L。

为了对传感器的优势做综合的评价，对比了以CoFe2O4NPs和其他纳米材料为基础的单宁酸传感器的表现。由表2可知，本实验体系拥有较好的线性响应区间（2个数量级），以及极低的检测限。相比于其他检测方法，CoFe2O4NPs-鲁米诺-H2O2体系对单宁酸的检测具有超高的灵敏度。

2.4 CoFe2O4NPs-鲁米诺-H2O2测定单宁酸传感器的选择性考察

一个良好的传感器除了具备灵敏度高的要求外，还必须有选择性高的要求。为了确定该体系检测单宁酸的选择性，考察了单宁酸的类似物维生素C、蔗糖、葡萄糖、苯甲酸、酒石酸、柠檬酸对检测体系的影响（图7）。本文所用单宁酸浓度为1.0×10-8mol/L，维生素C、酒石酸浓度为1.0×10-7mol/L，苯甲酸的浓度为1.0×10-6mol/L，蔗糖、葡萄糖、柠檬酸的浓度为1.0×10-5mol/L。结果表明，1000倍的蔗糖、葡萄糖、柠檬酸，100倍的苯甲酸，10倍的维生素C、酒石酸对单宁酸的测定不会产生干扰，该检测体系选择性较好。

表2 以CoFe2O4NPs为基础的单宁酸传感器与其他纳米材料为基础的单宁酸传感器的表现对比

图7 CoFe2O4NPs-鲁米诺-H2O2体系测定单宁酸的选择性考察

3 结论

本文利用单宁酸抑制CoFe2O4NPs-鲁米诺-H2O2体系化学发光的现象，探讨该反应体系化学发光的机理，系统研究了影响该反应体系化学发光的一系列因素，建立了一种方便快速的单宁酸超灵敏检测方法。结果表明，在最佳实验条件下，单宁酸浓度与该体系化学发光强度比（I/I）的双对数具有良好的线性关系，其线性范围为5.0×10-9～5.0×10-7mol/L，检测限为2.5×10-10mol/L，而且该检测体系抗干扰性良好。通过此项研究，有利于拓宽单宁酸的检测渠道，助力食品安全。

[1] 宋妍妍，陈代文，余冰，等. 单宁酸的营养生理功能及其在单胃动物生产中的应用研究进展[J]. 动物营养学报，2019, 31(06): 2544-2551.

[2] 徐阳纯，许泽群，王志强，等. 分光光度法测定桃金娘果单宁的含量[J]. 中国食品添加剂，2020, 31(12): 25-30.

[3] ZHANG X D, HUANG Y M. Evaluation of the antioxidant activity of phenols and tannic acid determination with Mn3O4nano-octahedrons as an oxidase mimic[J]. Analytical Methods, 2015, 7(20): 8640-8646.

[4]XIE X, CHEN X, WANG Y, et al. High-loading Cu single-atom nanozymes supported by carbon nitride with peroxidase-like activity for the colorimetric detection of tannic acid [J]. Talanta, 2023, 257: 124387-124394.

[5] 张素华. 滴定标准曲线法测定核桃青皮中单宁质量分数[J]. 东北林业大学学报，2017, 45(02): 39-41.

[6] 张学玲，刘霞，蒋媛，等. 高效液相色谱法测定酿酒葡萄中单宁酸的含量[J]. 现代食品，2022, 28(21): 207-211.

[7] VU D L, ERTEK B, DILGIN Y, et al. Voltam metric determination of tannic acid in bever ages using pencil graphite electrode[J]. Czech Journal of Food Sciences, 2015, 33(1): 72-76.

[8] 章冉，田湉，安然，等. 卵清蛋白沉淀法分析干红葡萄酒的涩感质量[J]. 食品科学技术学报，2016, 34(04): 80-84.

[9] YANG H, HE L, PAN S, et al. Nitrogen-doped fluorescent carbon dots for highly sensitive and selective detection of tannic acid[J].Spectrochimica Acta, Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2019, 210: 111-119.

[10] AHMED G H G, LAINO R B, CALZON J A G, et al. Fluorescent carbon nanodots for sensitive and selective detection of tannic acid in wines[J].Talanta, 2015, 132: 252-257.

[11] LIU X N, ZHANG W T, YANG C Y, et al. Rapid and selective fluorometric determination of tannic acid using MoO3-quantum dots [J]. Microchimica Acta, 2019, 186(4): 237.

[12] ZHU X, YU J, YAN Y, et al. One-pot alkali cutting-assisted synthesis of fluorescence tunable amino-functionalized graphene quantum dots as a multifunctional nanosensor for sensing of pH and tannic acid[J]. Talanta, 2022, 236: 122874-122881.

[13] 朱秋菊. 化学发光功能化纳米材料的合成、性质的研究及其分析应用[D]. 合肥：中国科学技术大学，2020.

[14] SHI W B, ZHANG X D, HE S H, et al. CoFe2O4magnetic nanoparticles as a peroxidase mimic mediated chemiluminescence for hydrogen peroxide and glucose[J]. Chemical Communications, 2011, 47: 10785-10787．

[15] 何余生，李忠，奚红霞，等. 气固吸附等温线的研究进展[J]. 离子交换与吸附，2004(04): 376-384.

[16] LIU Y, HAN S Q. Chemiluminescence of nitrogen-doped carbon quantum dots for the determination of thiourea and tannic acid[J]. Food Analytical Methods, 2017, 10(10): 3398-3406.

[17] LI G W, HONG L, TONG M S, et al. Determination of tannic acid based on luminol chemiluminescence catalyzed by cupric oxide nanoparticles[J].Analytical Methods, 2015, 7(5): 1924-1928.

Ultra-sensitive detection of tannic acid based on CoFe2O4NPs-luminol-H2O2chemiluminescence system

LUO Fen-qiang1,2

(1.Zhangzhou Food Industry Research Institute, Zhangzhou Institute of Technology, Fujian Zhangzhou 363000, China; 2.College of Chemical Engineering, Zhangzhou Institute of Technology, Fujian Zhangzhou 363000, China)

In this paper, a simple, rapid and ultra-sensitive tannic acid detection method was established for the first time by using CoFe2O4NPs to catalyze the chemiluminescence of luminol-H2O2, combined with the property that tannic acid can inhibit the catalytic activity of CoFe2O4NPs. Under optimum conditions, experimental results showed that the linear range and detection limit of CoFe2O4NPs-luminol-H2O2system for tannic acid were 5.0×10-9～5.0×10-7mol/L and 2.5×10-10mol/L, respectively. Compared with other detection methods, the detection limit is extremely low, and the detection system has good selectivity. This method is expected to be applied to the determination of tannic acid in food and water samples.

CoFe2O4；nanoparticles；catalysis；chemiluminiscence；tannic acid

O655

A

1007-984X(2023)06-0084-06

2023-04-10

漳州市食品产业技术研究院开放课题资助（ZSY2022110）；福建省中青年教师教育科研项目（JAT220691）；漳州职业技术学院博士科研启动基金（ZZYB2208）

骆奋强（1989-），男，福建漳州人，讲师，博士，主要从事化学与生物传感研究，luofenqiang1989@qq.com。