刘荣　张正学　刘清国　党志国　吴小波　黄海

关键词：杧果；SSR 标记；毛细管电泳；DNA 指纹图谱；DNA 分子身份证

中图分类号：S667.7 文献标识码：A

杧果（Mangifera indica Linn.），是一种热带亚热带常绿乔木果树，属漆树科（Anacardiaceae）杧果属（Mangifera）[1-2]。因其果实香甜、营养丰富、肉质细滑多汁，被称为“热带果王”，备受消费者青睐[3]。杧果原产于印度，我国于20 世纪初引进象牙杧杧果，已收集保存杧果种质资源1000 余份，结合实生选种、杂交育种等育种方法创制了热农1 号、红玉杧、桂热82 号等优良品种[4]。以杧果品种阿方索为试材，通过测序和组装得到了393 Mb 的基因组图谱[5]。目前，我国杧果主要种植在海南、广西、四川等热带亚热带地区，其种植面积达343 400 hm2，产量达331.2 万t，居世界第二位[6-7]。

目前，应用于杧果遗传育种的分子标记技术有SSR[8]、RAPD[9]、AFLP[10]等。SSR（simplesequence repeats， SSR）标记是一种以特异引物PCR 为基础的分子标记技术，具有数量丰富、多态性高；以孟德尔方式遗传，呈共显性；技术重复性好、易操作等特性[11]。近年来，SSR 标记被广泛应用于植物遗传多样性分析和指纹图谱构建，在水稻[12]、大豆[13]以及黄瓜[14]等作物上已有报道。孙浩男等[15]利用MISA 软件以金鸡菊为试材，检测得到6546 个SSR 位点；结合引物筛选成功开发出22 对多态性较好的引物，扩增得到166 个多态性条带。冯鹏龙等[16]以辣椒为试材，筛选得到6 对多态性较好的引物，共扩增到36 个基因位点，多态性比例为97% ； 并选用pepperSSR01 、pepperSSR04、pepperSSR06、pepperSSR08 构建了供试辣椒材料的指纹图谱。董聚苗等[17]利用28f4、CH04f10、GD142 共3 对SSR 引物构建了74 个观赏海棠品种的指纹图谱。本研究采用SSR标记构建19 份杧果品种（系）的DNA 指纹图谱和DNA 分子身份证，旨在为杧果遗传育种提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供试材料于2020 年9 月在贵州省兴义市南盘江镇田房村收集。采集杧果秋稍上的幼嫩叶片，将叶片用吸水纸吸干后放入装有变性硅胶的采样袋中，写好标签后带回实验室备用。

1.1.2 试剂与仪器 Taq Plus DNA 聚合酶、10×PCR Buffer（含Mg）、dNTPs（10 mmol/L）、50×TAE、瓊脂糖H 等均采购于生工生物工程（上海）股份有限公司，6×DNA Loading Dye、DNALadder Mix（100～3000 bp）、POP-7 Polymer和HiDiForma-mide 采购于ThermoFisher （AppliedBiosystemsTM）公司。

VeritiTM 96well 型PCR 仪购自美国ABI 公司；FR-980A 型凝胶成像仪购自上海复日科技有限公司；3730XL 型测序仪购自美国ABI 公司；SMA4000型UV-Vis Spectrophotometer 购自Merinton 公司；TD5A-WS 型台式高速离心机购自湖南湘仪实验仪器开发有限公司；F619703-05 型BP 系列精密单道可调移液器购自加拿大BBI 公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA 提取 以杧果幼嫩叶片为原材料，采用Ezup 柱式植物组织基因组DNA 抽提试剂盒提取杧果基因组DNA，具体操作步骤参照试剂盒说明书（产品编号：B518261）。

1.2.2 SSR 分析 所用SSR 标记引物序列来源于前人的研究开发[18-20]，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反应体系：10 μmol/L正反向引物各 0.5 μL，5 μmol/L dNTPs 0.5 μL，10×Taq buffer （含Mg2+） 2.5 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，20～50 ng/μL 基因组DNA 1 μL，ddH2O 19.8 μL。PCR 反应程序：94 ℃预变性5min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10 个循环；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环；72 ℃修复延伸10 min，4 ℃保存。引物筛选时，PCR 产物通过PAGE 检测；毛细管电泳时，将筛选得到的SSR 引物进行5修饰，得到的PCR 产物使用3730XL 设备进行检测。

1.3 数据处理

采用Genemapper 软件分析获得扩增片段大小。DNA 指纹图谱代码、DNA 分子身份证的构建参照郭艳春等[21]和李志强等[22]的方法，即：将每一对引物扩增得到的所有等位基因按照从小到大的顺序进行排列，先用数字1～9 依次排序，超出9 的部分用字母顺序排列，构建形成19 个杧果品种（系）的指纹图谱代码。每个品种的条形码DNA 分子身份证和二维码DNA 分子身份证分别在网址http：//t-x-m.com/和http：//t-x-m.com/QRCode/QRCodeGenerator.asp 上完成。

2 结果与分析

2.1 19 个杧果品种（系）的基本特性

19 个杧果品种（系）主要从广西、海南引进以及贵州自育品系中获得，其中8 个品系处于中期试验阶段，待鉴定；11 个品种（系）是单胚，8 个品种（系）是多胚；其基本特性如表1 所示。

2.2 引物筛选

根据所选材料的表型特征，选择其差异较大的5 份杧果材料（红象牙杧、金煌杧、红杧6 号、红玉杧、南逗迈4 号杧）为模板，经PCR 扩增以及PAGE 电泳检测，从115 对引物中筛选得到稳定性较好、多态性较高的引物9 对，并采用HEX、FAM 两个荧光标记对引物进行5端修饰（毛细管电泳检测备用），引物详细信息见表2。

2.3 DNA 指紋图谱构建

对筛选得到的9 对引物进行荧光标记后，毛细管电泳检测19 份杧果品种（系），构建其DNA指纹图谱。扩增片段大小通过数字和字母对每对引物的多态性位点进行编码，如表3 所示，9 对引物扩增得到多态性条带数158 条，其中引物M53 含有19 个多态性位点，从小到大依次是：167.44/175.74（1）、167.44/188.75（2）、168.34/176.5（3）、168.4/184.64（4）、168.42/176.72（5）、168.58/176.81（6）、175.6/179.53（7）、175.63/179.6（8）、176.48/184.63（9）、176.58/182.55（A）、176.61（B）、176.64/182.62（C）、176.69/182.61（D）、176.69/188.69（E）、176.71/182.57（F）、176.79/182.72（G）、176.85/188.87（H）、177.5/179.55（ I ） 、177.65/181.71（J）。

依据表3 的多态性片段编码，按照引物M9、M15、M35、M40、M53、M59、M101、M102、M103 顺序，通过每个品种对应的每个引物多态性位点进行组合统计，构建形成19 份杧果品种（系）的指纹图谱代码（表4）。如金煌杧，通过9 个SSR 位点毛细管电泳检测得到带型（图1），统计分析形成其指纹图谱代码为9EE9F8933，对应表3 表示第1 个数字9 表明杧果品种金煌杧对应引物M9 的扩增片段在该引物多态性片段梯度中排第9；第2 个字母E 表明杧果品种金煌杧对应引物M15 的扩增片段在该引物多态性片段梯度中排第14；第3 个字母E 表明杧果品种金煌杧对应引物M35 的扩增片段在该引物多态性片段梯度中排第14；后续代码以此类推。将19 个品种（系）的指纹图谱代码和基本信息导入在线条形码生成程序、二维码生成程序，得到各品种的条形码DNA 分子身份证和二维码DNA 分子身份证（表4）。

3 讨论

由于SSR 标记具有共显性、等位变异多、重复性好等优势，已被广泛应用于果树DNA 指纹图谱构建。本研究从115 对引物中初步筛选得到多态性较好的引物9 对，毛细管电泳检测19 份杧果品种（系），依据扩增片段大小对每对引物的多态性位点进行编码，9 对引物扩增得到多态性条带数158 条，其中引物M53 含有19 个多态性位点，这与黄丽芳等[23]、王明等[19]的研究结果相似。

DNA 分子身份证由于可以直观便捷呈现品种信息，在品种识别、鉴定等方面得以广泛应用。武志江等[24]采用20 对SSR 标记引物，结合数字和小写字母对145 份火龙果不同带型进行编码，成功构建了火龙果种质资源的DNA 分子身份证，实现不同种质资源的有效区分。侯丽媛等[25]选取7 对荧光SSR 引物，并运用条形码技术生成了‘赤霞’的分子身份证。白晓倩等[26]利用6 对SSR 引物构建了55 份板栗品种的DNA 分子身份证，这对板栗品种的识别和鉴定提供了参考价值。相对这些果树来说，SSR 分子标记在杧果DNA 分子身份证构建方面的应用相对较少。本研究通过PCR 扩增得到多态性片段编码，按照引物M9、M15、M35、M40、M53、M59、M101、M102、M103 顺序对19 份杧果品种（系）的指纹图谱代码进行编辑，构建了19 份杧果品种（系）的DNA分子身份证，为标准化构建杧果DNA 分子身份证库奠定基础。

4 结论

本研究以19 个杧果品种（系）为试材，利用荧光标记的9 对引物，通过毛细管电泳检测后，结合“数字+字母”处理获得19 个杧果品种（系）的指纹图谱代码、条形码DNA 分子身份证和二维码DNA 分子身份证，为标准化构建杧果DNA分子身份证库奠定基础。