梁成真，金双侠

·导读·

我国耐除草剂棉花研发与育种应用

梁成真1，金双侠2

1中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081；2华中农业大学植物科学技术学院/作物遗传改良全国重点实验室，武汉 430070

棉花是世界上最主要的天然纤维来源，也是重要的油料和饲料兼用作物，在国民经济中具有重要的战略地位[1-3]。经过近30年的努力，我国基本解决了棉铃虫危害，棉花单产居世界前列，优质进程也明显加快[4]。近年来，草害上升为我国棉花生产的主要危害之一。棉田杂草不仅竞争水分、养分和光照，而且滋生病害和虫害，严重影响棉纤维的产量和品质，给棉花生产带来极大危害[5-6]，成为亟待解决的产业问题。1996年全世界第一例转基因耐除草剂大豆GTS40-3-2商业化以来，耐除草剂作物在玉米、大豆和棉花等作物中得到广泛的应用[7]。目前，具有耐除草剂性状作物占全球转基因作物种植面积的80%左右[7-9]。美国率先通过导入用根癌农杆菌（sp. CP4）5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）编码基因获得耐草甘膦除草剂棉花，并于1997年商业化种植。由于其显著的经济、社会和生态效益，耐除草剂棉花全美种植面积占比从1997年的3.2%增加到2005年的60%，目前稳定在90%左右[7-9]。近年来，我国在耐除草剂新基因克隆和耐除草剂棉花种质创制等方面都取得显著的进展，且部分耐除草剂种质已进入农业转基因生物安全性评价流程[10]，但是，我国自主知识产权的耐除草剂棉花产业化应用仍然滞后。本专题展示了我国耐除草剂棉花创制和转基因安全性评价的研究进展，以期加快国产耐除草棉花的育种应用，为培育高产优质高抗棉花新品种提供种质资源和应用指导。

农杆菌介导法是棉花广泛应用的遗传转化方法，具有效率高、拷贝数低、稳定性好等优点[11]。然而，利用农杆菌介导遗传转化法进行基因操作时，T-DNA整合到植物染色体的位置具有随机性，可能会导致外源或内源基因表达的沉默或功能缺失[12]。陆地棉占棉花总产的95%以上，但由于其基因组是复杂的异源四倍体，基因组较大且含有高比例的重复序列[1-3]，棉花遗传转化中T-DNA序列整合位点以及边界序列的状态尚难以精准的控制。因此，对比研究转基因作物不同世代的外源基因DNA整合、基因表达、蛋白表达、目的性状及农艺性状等遗传稳定性，是转基因作物商业化应用的前提[13]。本专题论文《耐除草剂棉花GGK2的遗传稳定性分析及性状鉴定》[14]对连续3代转基因棉花GGK2的检测结果显示，外源目的基因稳定的整合到棉花基因组中，目的基因、和筛选标记基因的拷贝数、蛋白表达量、草甘膦耐受性以及农艺性状等在不同代际间均无显著差异，并且转基因棉花GGK2能够耐受田间使用中剂量4倍的草甘膦浓度，农艺性状和营养品质与对照组相比无显著差异，达到了生产用耐除草剂棉花对草甘膦除草剂的耐受水平。未来，与生产中广泛应用的国产抗虫棉品种杂交，可获得同时抗棉铃虫和耐除草剂的棉花新品种。总之，转基因棉花GGK2是高耐除草剂且稳定遗传的转基因材料，目前已经进入转基因安全性评价生产应用证书申报阶段，具有广阔的产业化应用前景。

草甘膦除草剂自1974年商业化以来，成为世界上用量增长最快、生产量最大的农药，目前年用量100万t左右，占全世界除草剂市场份额的30%以上[7-10]。近年来，除了之外，从抗草甘膦的微生物中分离鉴定到数个类基因并应用于耐除草剂作物的培育，如[15]、[16]、[6]、[10]等。尽管都属于EPSPS类蛋白，但是它们和CP4 EPSPS序列相似性相对较低，因此，能够获得专利权，为培育具有自主知识产权的耐除草剂作物提供了基因基础。本专题论文《转+耐草甘膦优异棉花种质系的创制及其特性》[17]利用耐辐射奇球菌（）EPSPS基因转化中棉所49，获得3个稳定遗传的单拷贝整合的转化体ZD131、ZD185和ZD207，T-DNA插入位点分别在D7、D13和A12染色体。3个转基因株系均耐受4倍田间草甘膦推荐剂量且生长发育正常。有意思的是，转基因株系棉铃大小、衣分、结铃性等产量性状和纤维品质均优于对照组，说明其具有较好的应用潜力。本专题另外一篇论文《转基因抗草甘膦棉花R1-3株系的分子特征鉴定》[18]利用农杆菌介导法转化基因，获得稳定遗传的耐草甘膦除草剂棉花R1-3。同样，R1-3棉花中T-DNA为单拷贝插入，整合位点在A11或D11染色体基因间隔区，未破坏受体棉花的内源基因，也未发现对插入位点附近基因表达的影响。ZD系列和R1-3等耐除草剂棉花的创制，丰富了我国自主知识产权耐除草剂棉花种质资源的储备，与GGK2棉花共同形成了国产耐除草剂棉花产业应用的梯队系列产品，为保障我国耐除草剂棉花稳定健康发展奠定了资源基础。

尽管草甘膦是全球第一大除草剂品种，但是长期大面积使用单一类型的除草剂，容易导致杂草抗药性、基因逃逸、药害残留等问题[19]。研发安全高效且环境友好的新型除草剂，培育与之相匹配的抗性作物是未来解决草害问题的发展方向。近年来，功能基因组学、代谢组学、蛋白质组学等多组学的快速发展为解决杂草危害提供了新的切入点。同时，农业生物技术的快速发展，尤其是基因编辑技术在棉花中的广泛应用[19-28]，为培育新型耐除草剂棉花提供了新策略。本专题论文《后基因组时代发展抗除草剂作物的机遇及挑战》[29]从3个层面系统综述了耐除草剂作物的发展，一是除草剂靶标基因与作用机制研究层面，系统总结了几种不同作用机制的除草剂靶标基因，比如植物氨基酸生物合成、植物脂类代谢、植物类胡萝卜素、质体醌和生育酚生物合成途径的研究进展。二是新型耐除草剂基因挖掘与除草剂系统层面，重点介绍了2种挖掘新型抗除草剂基因与除草剂系统的方法，包括基于CRISPR/Cas系统对作物内源除草剂靶标基因进行定向突变、定向激活法和天然产物与生物体存在共同进化理论的抗性基因导向法。三是耐除草剂作物培育层面，系统总结了3种培育抗除草剂作物方法，包括常规育种培育法、转基因育种培育法和基于CRISPR/Cas基因组编辑技术培育法，并且重点介绍了CIRSPR/ Cas系统、碱基编辑技术和Prime-editing系统在培育抗除草剂作物中的研究进展。在后基因组时代，针对杂草防治中抗性杂草发生、环境安全和基因逃逸等挑战，基因组编辑技术的快速发展为杂草防治提供了新策略和机遇。

[1] Wen X P, Chen Z W, Yang Z R, Wang M J, Jin S X, Wang G D, Zhang L, Wang L J, Li J Y, Saeed S, He S P, Wang Z, Wang K, Kong Z S, Li F G, Zhang X L, Chen X Y, Zhu Y X. A comprehensive overview of cotton genomics, biotechnology and molecular biological studies. Science China Life Sciences, 2023: 1-43.

[2] YANG Z R, QANMBER G, WANG Z, YANG Z E, LI F G. Gossypium genomics: Trends, scope, and utilization for cotton improvement. Trends in Plant Science, 2020, 25(5): 488-500.

[3] HUANG G, HUANG J Q, CHEN X Y, ZHU Y X. Recent advances and future perspectives in cotton research. Annual Review of Plant Biology, 2021, 72: 437-462.

[4] 郭三堆, 王远, 孙国清, 金石桥, 周焘, 孟志刚, 张锐. 中国转基因棉花研发应用二十年. 中国农业科学, 2015, 48(17): 3372-3387.

GUO S D, WANG Y, SUN G Q, JIN S Q, ZHOU T, MENG Z G, ZHANG R. Twenty years of research and application of transgenic cotton in China. Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(17): 3372-3387. (in Chinese)

[5] 蔡晓虎, 林萍, 史亚辉, 韩睿, 张玉栋, 吴娜, 王俊刚. 扁秆荆三棱种群密度对棉花营养物质吸收和积累的影响. 棉花学报, 2020, 32(2): 143-150.

CAI X H, LIN P, SHI Y H, HAN R, ZHANG Y D, WU N, WANG J G. Effects of population density ofon the absorption and accumulation of cotton nutrients. Cotton Science, 2020, 32(2): 143-150. (in Chinese)

[6] 王霞, 马燕斌, 吴霞, 沈志成, 林朝阳, 李朋波, 孙璇, 王新胜, 李燕娥, 李贵全. 转棉花株系的获得及分子生物学鉴定. 中国农业科学, 2014, 47(6): 1051-1057.

WANG X, MA Y B, WU X, SHEN Z C, LIN C Y, LI P B, SUN X, WANG X S, LI Y E, LI G Q. Molecular biology identification of transgenic cotton lines expressing exogenousgene. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(6): 1051-1057. (in Chinese)

[7] DUKE S O, POWLES S B. Glyphosate: a once-in-a-century herbicide. Pest Management Science, 2008, 64(4): 319-325.

[8] Bonny S. Genetically modified herbicide-tolerant crops, weeds, and herbicides: Overview and impact. Environmental Management, 2016, 57(1): 31-48.

[9] DUKE S O, POWLES S B. Glyphosate-resistant weeds and crops. Pest Management Science, 2008, 64(4): 317-318.

[10] LIANG C Z, SUN B, MENG Z G, MENG Z H, WANG Y, SUN G Q, ZHU T, LU W, ZHANG W, MALIK W, LIN M, ZHANG R, GUO S D. Co-expression ofandyields herbicide-resistant cotton with low glyphosate residues. Plant Biotechnology Journal, 2017, 15(12): 1622-1629.

[11] SHILO S, TRIPATHI P, MELAMED-BESSUDO C, TZFADIA O, MUTH T R, LEVY A A. T-DNA-genome junctions form early after infection and are influenced by the chromatin state of the host genome. PLoS Genetics, 2017, 13(7): e1006875.

[12] DONG O X, RONALD P C. Targeted DNA insertion in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2021, 118(22): e2004834117.

[13] 李圣彦, 李香银, 李鹏程, 张明俊, 张杰, 郎志宏. 转基因玉米2HVB5的性状鉴定及遗传稳定性分析. 生物技术通报, 2023, 39(1): 21-30.

LI S Y, LI X Y, LI P C, ZHANG M J, ZHANG J, LANG Z H. Identification of target traits and genetic stability of transgenic maize 2HVB5. Biotechnology Bulletin, 2023, 39(1): 21-30. (in Chinese)

[14] 梁成真, 臧有义, 孟志刚, 王远, Mubashir Abbas, 何海焱, 周琪, 魏云晓, 张锐, 郭三堆. 耐除草剂棉花GGK2的遗传稳定性分析及性状鉴定. 中国农业科学, 2023, 56(17): 3251-3260.

LIANG C Z, ZANG Y Y, MENG Z G, WANG Y, MUBASHIR A, HE H Y, ZHOU Q, WEI Y X, ZHANG R, GUO S D. Identification of target traits and genetic stability of transgenic cotton GGK2. Scientia Agricultura Sinica, 2023, 56(17): 3251-3260. (in Chinese)

[15] GUO B F, GUO Y, HONG H L, JIN L G, ZHANG L J, CHANG R Z, LU W, LIN M, QIU L J. Co-expression ofand glyphosate acetyltransferasegenes conferring high tolerance to glyphosate in soybean. Frontiers in Plant Science, 2015, 6: 847.

[16] 梅磊, 陈进红, 何秋伶, 祝水金. 草甘膦对转基因棉花种质系配子育性的影响. 棉花学报, 2013, 25(2): 115-120.

MEI L, Chen J H, He Q L, Zhu S J. Effect of glyphosate on the gamete fertility of transgenic glyphosate-resistant cotton germplasms with EPSPS-G6. Cotton Science, 2013, 25(2): 115-120.

[17] 王宛如, 曹跃芬, 盛况, 陈进红, 赵天伦, 祝水金. 转+耐草甘膦优异棉花种质系的创制及其特性. 中国农业科学, 2023, 56(17): 3261-3276.

WANG W R, CAO Y F, SHENG K, CHEN J H, ZHAO T L, ZHU S J. The creation and characteristics of cotton germplasm lines transgenic+gene with excellent glyphosate tolerance. Scientia Agricultura Sinica, 2023, 56(17): 3261-3276. (in Chinese)

[18] 马燕斌, 李换丽, 文晋, 周仙婷, 秦欣, 王霞, 王新胜, 李燕娥. 转基因抗草甘膦棉花R1-3株系的分子特征鉴定. 中国农业科学, 2023, 56(17): 3277-3284.

MA Y B, LI H L, WEN J, ZHOU X T, QIN X, WANG X, WANG X S, LI Y E. Identification of molecular characterizations for transgenic cotton R1-3 line of glyphosate tolerance. Scientia Agricultura Sinica, 2023, 56(17): 3277-3284. (in Chinese)

[19] Li J Y, Manghwar H, Sun L, Wang P C, Wang G Y, Sheng H Y, Zhang J, Liu H, Qin L, Rui H P, Li B, Lindsey K, Daniell H, Jin S X, Zhang X L. Whole genome sequencing reveals rare off-target mutations and considerable inherent genetic or/and somaclonal variations in CRISPR/Cas9-edited cotton plants.Plant Biotechnology Journal,2019, 17(5): 858-868.

[20] YU L, Li Z S, DING X, ALARIQI M, ZHANG C J, Zhu X Q, Fan S L, Zhu L F, ZHANG X L, JIN S X. Developing an efficient CRISPR/dCas9-TV-derived transcriptional activation system to create three novel cotton germplasm materials. Plant Communications, 2023, 4(4): 100600.

[21] Wang G Y, Xu Z P, Wang F Q, Huang Y F, Xin Y F, Liang S J, Li B, Si H, Sun L, Wang Q Q, Ding X, Zhu X Q, Chen L, Yu L, Lindsey K, Zhang X L, Jin S X. Development of an efficient and precise adenine base editor (ABE) with expanded target range in allotetraploid cotton (). BMC Biology, 2022, 20(1): 45.

[22] Li B, Liang S J, Alariqi M, Wang F Q, Wang G Y, Wang Q Q, Xu Z P, Yu L, Zafar M N, Sun L, Si H, Yuan D J, Guo W F, Wang Y Q, Lindsey K, Zhang X L, Jin S X. The application of temperature sensitivity CRISPR/LbCpf1 (LbCas12a) mediated genome editing in allotetraploid cotton () and creation of nontransgenic, gossypol-free cotton. Plant Biotechnology Journal, 2021, 19(2): 221-223.

[23] Chen Y Z, Fu M C, Li H, Wang L G, Liu R Z, Liu Z J, Zhang X L, Jin S X. High-oleic acid content, nontransgenic allotetraploid cotton (L.) generated by knockout ofgenes with CRISPR/Cas9 system. Plant Biotechnology Journal, 2021, 19(3): 424-426.

[24] Wang Q Q, Alariqi M, Wang F Q, Li B, Ding X, Rui H P, Li Y J, Li J Y, Xu Z P, Qin L, Sun L, Li J Y, Zou J W, Lindsey K, Zhang X L, Jin S X. The application of a heat-inducible CRISPR/Cas12b (C2c1) genome editing system in tetraploid cotton () plants. Plant Biotechnology Journal, 2020, 18(12): 2436-2443.

[25] Manghwar H, Li B, Zhang X L, Jin S X. Strategies to overcome off-target effects by CRISPR/Cas system (2020). Advanced Science, 2020, 7(6): 1902312.

[26] Qin L, Li J Y, Wang Q Q, Xu Z P, Sun L, Alariqi M, Manghwar H, Wang G Y, Li B, Ding X, Rui H P, Huang H M, Lu T L, Lindsey K, Daniell D, Zhang X L, Jin S X. High efficient and precise base editing of C•G to T•A in the allotetraploid cotton () genome using a modified CRISPR/Cas9 system.Plant Biotechnology Journal, 2020, 18(1): 45-56.

[27] Li B, Rui H P, Li Y J, Wang Q Q, Alariqi M, Qin L, Sun L, Ding X, Wang F Q, Zou J W, Wang Y Q, Yuan D J, Zhang X L, Jin S X. Robust CRISPR/Cpf1(Cas12a) mediated genome editing in allotetraploid cotton (). Plant Biotechnology Journal, 2019, 17(10): 1862-1864.

[28] Wang P C, Zhang J, Sun L, Ma Y Z, Xu J, Liang S J, Deng J W, Tan J F, Zhang Q, Tu L L, Henry D,Jin S X, Zhang X L. High efficient multi-sites genome editing in allotetraploid cotton () using CRISPR/Cas9 system. Plant Biotechnology Journal,2018, 16(1): 137-150.

[29] 吴元龙, 惠凤娇, 潘振远, 尤春源, 林海荣, 李志博, 金双侠, 聂新辉. 后基因组时代发展抗除草剂作物的机遇及挑战. 中国农业科学, 2023, 56(17): 3285-3301.

WU Y L, HUI F J, PAN Z Y, YOU C Y, LIN H R, LI Z B, JIN S X, NIE X H. Opportunities and challenges for developing herbicide- resistance crops in the post-genomic era. Scientia Agricultura Sinica, 2023, 56(17): 3285-3301. (in Chinese)

Advancements in Herbicide-Tolerant Cotton Research and Breeding in China

LIANG Chengzhen1, JIN Shuangxia2

1Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;2College of Plant Science & Technology of Huazhong Agricultural University/National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Wuhan 430070

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.17.001

2023-07-27；

2023-08-01

国家自然科学基金（32072115）、中国农业科学院科技创新工程、中国农业科学院生物技术研究所基本科研业务费

通信作者梁成真，E-mail：liangchengzhen@caas.cn。通信作者金双侠，E-mail：jsx@mail.hzau.edu.cn

（责任编辑 李莉）