武春屹，罗莎莎，杨 婷，卢颖林，和锐敏，钮 越，张小莉，安玉兴

（1.华南农业大学植物保护学院，广东 广州 510642；2.广东省科学院南繁种业研究所，广东 广州 510316）

【研究意义】烟草作为我国重要的经济作物，在农业经济中扮演着重要角色。目前烤烟产区常年过量使用化肥，特别是氮肥的不合理施用，是导致土壤板结、有机质含量下降以及微生物区系失衡的主要原因［1-3］。因此改善土壤质量，提高土壤生产力，进而改善烟叶品质，成为烤烟产区丞待解决的问题。【前人研究进展】减少氮肥的使用可降低硝态氮和铵态氮在土壤中的积累，减少土壤无机态氮的淋溶［4-5］。单独减施氮肥容易导致作物产量下降、土壤有效养分降低、微生物多样性减少等问题，而配施微生物菌剂可缓解因供氮不足引起的一系列问题［6-7］。微生物菌剂作为改良土壤的重要肥料之一，对改善土壤具有重要作用［8］。土壤微生物的变化以及物种之间的相互作用对植物健康起着重要作用，施用微生物菌剂是土壤生物改良的典型措施，可通过调控土壤生态环境，从而改善土壤质量［9-10］。微生物菌剂中的有益微生物可通过产生植物激素类、维生素类和核酸类等物质来改善土壤结构，提高植物溶磷、固氮、解钾能力，从而达到改善土壤环境、提高作物品质、减少对化肥的依赖性的目的［11-13］。研究表明，微生物菌肥对促进烟株生长、改善土壤理化性质、提高烟叶品质、提高土壤微生物多样性等方面有显著作用［14-17］。李茜等［18］研究发现，施用微生物菌肥可显著提升烤烟农艺性状、降低烟株发病率及发病指数，提高烤后烟叶香气物质含量。化党领等［19］研究发现，施用生物有机肥可显著提高烟叶各处理类胡萝卜素、类西柏烷类、苯丙氨酸类，新植二烯类和其他类别香气物质含量。傅献忠等［20］研究表明，施1 200 kg/hm2的烤烟专用复合微生物肥有利于中部烟叶香气量增加，减少杂气和刺激性；施1 800 kg/hm2时上部烟叶有杂气和刺激性减轻、余味变舒适的趋势。李怡博等［21］研究发现，微生物菌剂配施高碳基肥料可显著提高土壤微生物多样性，并且增加土壤中碱解氮、速效磷、速效钾和有机质含量。张良［22］通过大田试验发现，微生物菌剂配合有机无机肥施用可使烤烟化学成分更加协调，提高了烤烟总糖、还原糖和钾含量。毛云等［23］研究发现，常规施肥配合施加微生物菌肥上等烟比例、上中等烟比例产量、产值和均价分别提高4.4%、3.8%、5.8%、11.51%和5.73%。姜永雷等［24］研究发现，随着连作年限的增加，施加微生物菌剂的土壤和未施加微生物菌剂相比，有机碳、全氮、有效磷含量呈上升趋势。【本研究切入点】目前，常规施肥条件下配施微生物菌剂对烤烟产量和烟田土壤改良的研究较为多见，但在减氮条件下配施微生物菌剂却少有报道。【拟解决的关键问题】本研究通过探讨微生物菌剂配合减氮施肥对烤烟产量及土壤微生物多样性的影响，以期进一步探讨微生物菌剂替代部分氮肥的可行性，为实现烟田化肥减施增效提供理论依据及技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2022 年2—6 月于梅州市五华县岐岭镇（24°06′ N，115°49′ E）进行，该区属亚热带季风气候，2022 年年均气温21.8 ℃，年降雨量1 617 mm，年总日照时数2 215.1 h。试验地耕作方式为水稻-烟草连作。

供试烤烟为当地主栽品种为云烟87。微生物菌剂为广东省科学院南繁种业研究所自主分离发酵的甲基杆菌（Methylobacterium populi）菌剂，保藏编号为GDMCC No：61052，该菌剂已被证明有较好的促生长和固氮效果，且已在辣椒苗上应用有较好的促生作用［25］。

1.2 试验方法

试验采用随机区组设计，设T1 当地常规施肥（CK）、T2 常规施肥＋微生物菌剂、T3 常规施肥减氮10%＋微生物菌剂、T4 常规施肥减氮20%＋微生物菌剂4 个处理，每个处理3 次重复，小区面积30 m2，烟草种植行距为1.1 m。施肥量参考当地常规施肥标准，T1、T2 处理每667m2N、P2O5、K2O 用量分别为9.0、4.5、22.5 kg，T3 处理每667m2N、P2O5、K2O 用量分别为8.1、4.5、22.5 kg，T4 处理每667m2N、P2O5、K2O 用量分别为7.2、4.5、22.5 kg。微生物菌剂施用标准：将250 mL 菌液与水混合均匀，作为定根水施用，然后至打顶前每隔30 d 施用1 次，共施用4 次。微生物菌剂施用方法：烟草移栽时将微生物菌剂与定根水一起施入，移栽后至采收期每隔30 d 灌根1 次，每667m2施用量为每次5 L。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 烤烟农艺性状 按照国家标准YC/T142-2010［26］，选取小区长势均匀的10 株烟株进行挂牌标记，分别于团棵期、旺长期和成熟期测量株高、茎围、叶片数，上、中、下部位的叶长、宽。

1.3.2 烤后烟叶经济性状 各小区调制后烟叶分别挂牌标记、分级扎把，计算产量，按当地收购价格计算各处理经济性状。

1.3.3 土壤微生物多样性 于2022 年6 月烟草成熟期将0～30 cm 耕层烟草根系挖出，每小区3 株，抖落根系外围土，用消毒的软毛刷刷下根系表层的根际土壤，混合均匀后放入无菌封口袋，于-80 ℃保存，用于DNA 提取。

土壤微生物多样性测序采用第二代高通量测序技术，对烟株成熟期采集的土壤样本进行细菌16S rDNA 和真菌ITS DNA 序列检测，DNA 抽提和PCR 扩增、Illumina Miseq 测序和数据处理，参考陈乾锦等［27］的方法。

2 结果与分析

2.1 减量施氮配施微生物菌剂对烤烟农艺性状的影响

由表1 可知，不同处理对烤烟株高、茎围、叶片数无显著差异，总体来看，团棵期株高以T4处理最高（19.33 cm），茎围以T1 处理最大（5.00 cm）；旺长期株高以T2 处理最高（93.00 cm），茎围以T4 处理最大（8.33 cm）；成熟期株高以T4 处理最高（98.66 cm），茎围以T3 处理最大（8.66 cm）；团棵期叶片数的变化范围为11～13 片，旺长期为16～19 片，成熟期为13～16 片，表明一定范围内减氮配施微生物菌剂可稳定烤烟生长。

表1 不同处理对烤烟主要农艺性状的影响Table 1 Effects of different treatments on major agronomical traits of flue-cured tobacco

2.2 减量施氮配施微生物菌剂对烤烟经济性状的影响

由表2 可知，与T1 处理相比，其他处理烤后烟叶中上等烟比例无显著差异，上部上等烟比例以T1 处理最高（13.88%），中部上等烟比例以T2 处理最高（33.68%）；上部中等烟比例以T4 处理最高（33.65%），中部中等烟比例以T3处理最高（22.8%），下部中等烟比例以T3 处理最高（15.49%）；下等烟比例以T1 处理最高（13.88%），表明配施微生物菌剂可减少下等烟比例，增加中部上等烟和中等烟的比例。不同处理产量和产值表现为T2 ＞T3 ＞T1 ＞T4，其中T4 处理每667m2产值为1 351.56 元，低于其他处理，且较T2 处理差异显著；T3 处理产量和产值较T1 处理分别提高18.2%和12.5%，表明一定程度减氮配施微生物菌剂提高了烤烟产量和产值。

表2 不同处理对烤烟主要经济性状的影响Table 2 Effects of different treatments on major economic traits of flue-cured tobacco

2.3 减量施氮配施微生物菌剂对烟田土壤理化性质的影响

由表3 可知，相比T1 处理，其他处理土壤理化性质差异不显著，土壤不同理化指标如下：土壤pH（5.42～5.45 g/kg），有机质（43.09～45.72 g/kg），有机碳（25.00～26.52 g/kg），水溶性有机 碳（124.09～144.12 g/kg），全 氮（2.29～2.59 g/kg），全磷（1.30～1.53 g/kg），全钾（9.73～10.55 g/kg），碱解氮（232.51～240.12 mg/kg），有效磷（59.26～78.40 mg/kg），速效钾（460.20～576.72 mg/kg）；相比T1 处理，T3 处理全氮、速效钾含量有所增加，T4 处理全氮、全磷、全钾、碱解氮、有效磷和速效钾均有所减少但未达到显著水平，表明减氮配施微生物菌剂对土壤有效养分含量无显著影响。

表3 不同处理对烟田土壤理化性质的影响Table 3 Effects of different treatments on physicochemical properties of tobacco field soil

2.4 减量施氮配施微生物菌剂对根际土壤细菌和真菌群落多样性的影响

2.4.1 微生物群落α多样性 由Venn 图可知，烟田根际土壤细菌总OTUs 数共有7 857 个，T1、T2、T3、T4 处理分别为2 496、3 144、2 497、2 565 个，T2 较T1增加25.96%，T3、T4 与T1 无显著差异；T1、T2、T3、T4处理独有的OTUs 数分别为1 228、2 068、1 391、1 399 个，T2 较T1 增加68.4%（图1A）。真菌总OTUs 数量为2 554 个，T1、T2、T3、T4 处理分别为710、1 138、1 100、828 个，T2、T3、T4处理T1 分别增加60.2%、54.9%和16.6%，以T2 数量最多；T1、T2、T3、T4 处理独有的OUTs 数量分别为312、578、556、400 个，T2、T3 分别较T1增加85.2%和78.2%，其中T2 独有的OTUs 数量占比最大，表明施用微生物菌剂可以提高根际土壤细菌和真菌OUTs 群落总数和独有的OUTs 数量（图1B）。由图2、图3 可知，微生物菌剂T2、T3 处理显著提高了烟田根际土壤真菌的丰富度（Chao 指数），细菌丰富度无显著差异，真菌和细菌多样性无显著差异（Shannon 指数）。

图1 不同处理下根际土壤中细菌（A）和真菌（B）群落维恩图Fig. 1 Venn diagram of bacterial (A) and fungal (B) communities in rhizosphere soil under different treatments

图2 不同处理下根际土壤中细菌群落α 多样性指数Fig. 2 α diversity indexes for bacterial communities in rhizosphere soil under different treatments

图3 不同处理下根际土壤中真菌群落α 多样性指数Fig. 3 α diversity indexes for fungal communities in rhizosphere soil under different treatments

2.4.2 微生物群落β 多样性 属分类水平下对烟田根际土壤细菌群落结构组成的相似性分析表明，不同细菌群落结构差异显著（R=0.547，P=0.001）；基于Weighted Unifrac 距离的NMDS分析也表明，各土壤细菌群落明显分为4 类，不同处理对细菌群落结构分布影响显著（图4A）。属分类水平下的相似性分析表明，不同处理真菌群落结构为T1、T4 处理与T2、T3 处理差异显著（R=0.63，P=0.002）；NMDS 分析也表明，T1、T4 处理距离T2、T3 处理较远，即真菌物种组成有一定差异，T2 与T3 处理距离接近，表明T2 与T3 处理根际土壤的真菌组成较为相似，T1 和T4处理组成成分较为相似（图4B）。

图4 不同处理下根际土壤中细菌（A）和真菌（B）群落多样性的NMDS 分析Fig. 4 NMDS analysis of the bacterial (A) and fungal (B) communities diversity in rhizosphere soil under different treatments

2.4.3 微生物群落结构 由图5A、表4 可知，本试验条件下细菌物种相对丰度以变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、放线菌门（Actinobacteriota）、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadota）为主要菌门，其相对丰度分别占各处理总细菌丰度的78.3%（T1）、76.5%（T2）、82.5%（T3）、80.2%（T4），其中T4 处理变形菌门丰度高于其他处理，T4 和T1处理酸杆菌门丰度高于T2 和T3 处理。

图5 不同处理下根际土壤中细菌（A）和真菌（B）群落的相对丰度（门水平）Fig. 5 Relative abundance of bacterial (A) and fungal (B) communities in rhizosphere soil under different treatments (phylum level)

表4 不同处理对根际土壤中细菌门水平相对丰度的影响Table 4 Effects of different treatments on relative abundance of the bacterial communities in the rhizosphere soil at phylum level

由图5B、表5 可知，真菌优势菌门以子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、油壶菌门（Olpidiomycota）为主要菌门，其相对丰度分别占各处理总真菌丰度的90%（T1）、91%（T2）、91.5%（T3）、80%（T4）。真菌门水平各处理无显著差异。

表5 不同处理对根际土壤中真菌门水平相对丰度的影响Table 5 Effects of different treatments on relative abundance of the fungal communities in the rhizosphere soil at phylum level

由图6 可知，细菌属水平上物种相对丰度分别以未分类细菌（Unclassified-Bacteria）、芽单胞菌属（Gemmatimonadaceae）、硫 磺菌属（Vicinamibacteraies）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、厌氧绳菌属（Anaerolineaceae）为主要菌属，占总丰度的25%～30%。由图7 可知，真菌属水平上物种相对丰度分别以镰刀菌属（Fusarium）、油壶菌属（Olpidium）、毛壳属（Chatetomium）为主要菌属，占总丰度17%～30%。

图6 不同处理下根际土壤中细菌群落的相对丰度（属水平）Fig. 6 Relative abundance of bacterial communities in rhizosphere soil under different treatments (genus level)

图7 不同处理下根际土壤中真菌群落的相对丰度（属水平）Fig. 7 Relative abundance of fungal communities in rhizosphere soil under different treatments (genus level)

利用LefSe 分析研究不同处理间具有统计学差异的物种，由图8 可知，T1 处理细菌的标志性物种为未分类的酸杆菌门（p _Acidobacteriales）、全噬菌纲（c_Holophagae）、多囊菌目（o_Polyangiales）、中华单胞菌属（g_Sinomonas）、Pajaroellobacter属，T2 处理的标志性物种为绿弯菌科（f_Unclassified _Chloroflexi）、厌氧绳菌属（g_Unclassified_Anaerolineaceae）、硫磺球菌科（f_Vicinamibacteraceae）、未分类的芽单胞菌种（s_Unclassified_Gemmatimonadaceae），T3 处理的标志性物种为绿弯菌门（p_Chloroflexi）、纤线杆菌目（o_Ktedonobacteriales），T4 处理的标志性物种为α-变形菌纲（c_Alphaproteobacteria）、鞘氨醇单胞菌目（o_Sphingomonadales）、芽单胞菌属（g_Gemmatimonas）、拟杆菌纲（c_Bacteroidota）、丛毛单胞菌科（f_Comamonadaceae）、黄单胞菌科（f_Xanthomonadaceae）、黄杆菌目（o_Flavobacteriales）、草酸杆菌科（f_Oxalobacteraceae）、马赛菌属（g_Massilia）、慢生根瘤菌属（g_Bradyrhizobium）、拟单胞菌 目（o_Pyrinomonadales）、固氮螺菌属（g_Arenimonas）。由图9 可知，T1 处理真菌的标志性物种以隔孢假壳科菌种（s_Phaeosphaeria_thysanolaenicola）、镰刀菌种（s_Fusarium_equiseti）为主，T2 处理标志性物种以未分类丛赤壳属（g_unclassified_Nectriaceae）、罗兹菌门（p_Rozellomycota）、未分类毛壳菌种（s_Unclassified_Chaetomiaceae）为主，T3 处理标志性物种为粪壳菌纲（c_ Sordariomycetes）、毛壳菌科（f_Chaetomium），T4 处理标志性物种以阿太菌属（g_Athelia）和曲霉属（g_Aspergillus）为主。

图8 不同处理下细菌差异物种的分支Fig. 8 Branch of bacterial differential species under different treatments

图9 不同处理下真菌差异物种的分支Fig. 9 Branch of fungal differential species under different treatments

3 讨论

土壤供氮不足是引起烤烟种植产量和品质下降的主要原因之一［28-29］。微生物菌剂配合减氮施肥与常规施肥相比产量未降低，可能是由于微生物菌剂中的活菌代谢活动直接影响了烤烟生长过程中的碳氮代谢，从而间接影响烤烟的呼吸作用和光合作用以及同化物分配规律等［30-32］，促进了烤烟成熟期的充分成熟。

土壤微生物在土壤养分转化和循环、有机质的分解等方面起着重要作用，是土壤肥力关键指标之一［33］。研究表明，高剂量的氮肥施用是造成土壤质量恶化的主要原因之一，而低剂量的氮肥施用容易造成土壤养分降低，进而导致微生物多样性下降［34］，微生物菌剂的施用可缓解因供氮不足引起的微生物多样性降低［35］。本研究中，T2、T3 处理与T1 处理相比，烟田根际土壤真菌OTUs 数量和真菌丰富度（Chao 指数）显著提高，这与Yang 等［36］研究结果一致，原因可能是微生物菌剂的施用促进土壤真菌繁殖，增加了适宜真菌的生存空间和营养竞争。微生物菌剂含有的有益微生物能够刺激土壤中微生物数量的增加，较高的微生物数量和丰富度有利于土壤中氮磷钾等营养元素的吸收利用［37-38］，从而间接影响烤烟的产量和质量。

微生物菌肥的施用不仅能提供比化肥更丰富的养分，还可以将自带的有益微生物引入土壤，激活土壤中有益微生物的活性［39-41］。本研究高通量测序结果表明，不同施肥处理细菌组成主要为变形菌门、酸杆菌门、放线菌门，其次为绿弯菌门、芽单胞菌门等，其中T4 处理较其他处理显著提高了变形菌门的相对丰度，这与苏梦迪［42］、桑文等［43］的研究结果一致，变形菌门能利用土壤中的复杂有机物和植物秸秆作为碳源和氮源。本试验中，T4 处理的变形菌门显著高于其他处理，可能是外源氮素的不足促进了变形菌门的生长以有效降解吸收土壤中的难溶性养分，从而维持烤烟的正常生长，变形菌门对土壤难溶性养分的降解可能是减氮后土壤养分与常规施氮处理无显著差异的原因之一。变形菌门是一种革兰氏阴性菌，能够在不同的土壤环境中占据主导地位，变形菌门中包含着大量改善土壤环境的有益微生物，它的许多类群与根瘤菌的共生固氮有关［44］。配施微生物菌剂影响了优势菌种的组成，从而使土壤微生物环境更稳定。因此，配施微生物菌剂可能是导致土壤中变形菌门提高的主要原因，具体原因有待进一步探究和验证。不同处理真菌组成主要为子囊菌门、担子菌门和壶菌门，各处理间无显著差异。环境因素可能会影响较低分类单元的微生物群落结构组成，而对门分类水平则影响较小［45］。

通过配合施用微生物菌剂并未显著提高土壤微生物群落多样性，这与Poulsen 等［46］研究结果一致，主要原因为群落结构的改变，增加/减少的类群可以被其他减少/增加的类群补偿。通过LefSe 分析表明，不同处理之间微生物群落组成变化明显。本试验发现，T4 处理的标志性物种为α-变形菌纲、鞘氨醇单胞菌目、芽单胞菌属、拟杆菌纲、慢生根瘤菌属、固氮根瘤菌属等。前人研究发现，这些细菌都是促进植物生长的有益菌［47-48］，猜测原因为外源微生物菌剂刺激了土壤中有益菌的生长，具体原因有待进一步验证。变形菌中包含大量农田生态系统中的有益微生物，α-变形菌纲属于变形菌门的一个纲，是陆地土壤中的优势菌，其中的根瘤菌具有固氮功能［49-50］。鞘氨醇单胞菌和芽单胞菌属于根际促生菌，能够在作物生长过程中减少病害的发生并促进根系的生长，同时促进动植物残体的分解和养分的释放［51-53］。拟杆菌与土壤大团聚体含量密切相关［54］。慢生根瘤菌属、固氮根瘤菌属等是禾本科植物主要的固氮菌，能够为植物提供其生长所需的大量氮素［55］。减氮配施微生物菌剂能够为土壤中有益微生物提供适宜的生长环境，促进有益微生物的富集。土壤中有益微生物的增加能够促进烟株生长发育、提高烟叶品质和植物抗逆性。T1 处理真菌差异性物种表现为镰刀菌种的数量高于其他处理，可能原因为其他处理由于微生物菌剂的施用导致有益微生物对潜在病原的拮抗，镰刀菌是一种引起烟草枯萎病和根腐病危害极大的真菌病害［56-57］。微生物菌剂中的有益菌可通过产生抑菌活性物质抑制病原菌的生长，保护植物免受病原菌的侵染［58］。Shen 等［59］研究发现施用微生物菌肥可显著降低镰刀菌的丰度，减少枯萎病的发生。本研究通过分析烤烟农艺性状、经济性状、土壤理化性质和微生物群落结构，初步明确了减氮配施微生物菌剂施肥技术在稳产和土壤改良中的可行性，本试验后期会结合长期定位试验进一步探讨其机理研究。

4 结论

本研究结果表明，减氮施肥配施微生物菌剂稳定了烤后烟叶总产量，常规施肥配施微生物菌剂和减氮10%配施微生物菌剂烤烟产值较常规施肥分别增加12.8%和12.5%。微生物菌剂处理显著提高了烟田根际土壤细菌和真菌OTUs 数量以及其独有的OTUs 数量，常规施肥配施菌剂和减氮10%配施菌剂显著提高了真菌丰富度。减氮20%配施微生物菌剂显著提高了土壤中优势菌变形菌门的相对丰度，并且显著增加了土壤中α-变形菌纲和鞘氨醇单胞菌目等有益菌的相对丰度，改善了土壤细菌群落结构。综上所述，减氮10%配施微生物菌剂效果最好，在稳产的同时烤烟产值较常规施肥提高12.5%，且增加了烟草根际土壤中有益细菌的相对丰度和真菌OTUs 数量及真菌丰富度。