李晨曦，吴慧欣,2，吴玉娇，陈 洁，孟宪志，潘国庆，龙梦娴

（1.西南大学资源昆虫高效养殖与利用全国重点实验室/微孢子虫感染与防控重庆市重点实验室，重庆 400715；2.西南大学蚕桑纺织与生物质科学学院，重庆 400715）

【研究意义】凡纳滨对虾原产于太平洋沿岸，目前是我国主要的对虾养殖品种之一，年产量可高达百万吨［1］。但凡纳滨对虾常遭受病毒、细菌和真菌等病原感染，给全球对虾养殖业造成严重经济损失［2］。2004 年泰国新发现了一种对虾病原，2009 年鉴定为微孢子虫，命名为虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）。EHP 主要感染对虾肝胰腺，通过影响宿主免疫和代谢，抑制对虾正常生长发育甚至危及存活率［3-5］。2013年我国首次检出EHP，至今已传播至各大养殖区，极大地威胁国内对虾养殖业的健康发展［6-8］。迄今已发现200 多属、1 700 多种微孢子虫［9-11］，它们具有相似且特殊的侵染方式，即适宜环境条件下，刺激微孢子虫发芽，极管迅速弹出，病原性孢原质通过此中空管道运输至宿主细胞内。研究发现，水通道蛋白参与激活微孢子虫发芽［12-14］。为有效防控虾肝肠胞虫，揭示其侵染机制显得尤为重要。【前人研究进展】水通道蛋白作为细胞膜上的跨膜蛋白，参与水和小分子溶质跨膜的双向运输，几乎存在于所有生物中。水通道蛋白以四聚体形式存在，每个单体都会形成具有高度选择性的中空通道以运输合适分子。目前，已发现300 多种不同的水通道蛋白，其中人的水通道蛋白有13 种亚型，分别是AQP0～AQP12［15］。水通道蛋白由6 个α-螺旋跨膜结构域组成，具有2 个保守基序NPA（Asn-Pro-Ala）、5 个环结构（A～E 环），汞离子通过作用于E 环上NPA 基序前的半胱氨酸位点可逆地抑制水通道蛋白功能［16-17］。Frixione 等［14］利用HgCl2处理按蚊微孢子虫（Nosema algerae），发现HgCl2可显著抑制按蚊微孢子虫发芽，推测水通道蛋白参与按蚊微孢子虫的发芽过程。2006 年Ghosh 等［18］从兔脑炎微孢子虫（Encephalitozoon cuniculi）中鉴定到首个微孢子虫水通道蛋白EcAQP，其具有保守的水通道蛋白序列特征，将其编码基因转染至非洲爪蟾卵母细胞中异源表达，发现该卵母细胞的通透性显著增加，表明EcAQP 具有促进水渗透的功能。Chen 等［19］从家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）基因组中克隆得到NbAQP，发现NbAQP蛋白定位于成熟孢子的孢壁，并且NbAQP 抗体能有效抑制孢子发芽率，进一步证实了水通道蛋白在微孢子虫发芽中发挥重要功能。【本研究切入点】目前虾肝肠胞虫全基因序列测序分析已经完成［20］，但有关EHP 水通道蛋白的研究尚未见报道。鉴于此，本研究以虾肝肠胞虫水通道蛋白EHP00_492 为试验对象，对其编码基因进行克隆，预测其蛋白质的序列与结构特征，分析该蛋白在EHP 成熟孢子中的表达定位特征。【拟解决的关键问题】本研究从虾肝肠胞虫EHP 的cDNA 中克隆EHP00_492基因；通过生物信息学方法分析其编码蛋白的序列特征、三维结构特征及其与同源蛋白间的亲缘关系；构建重组表达载体pCold-TF-EHP00_492，转化大肠杆菌异源表达，纯化重组蛋白并制备多克隆抗体；分析EHP00_492在EHP 成熟孢子中的表达及亚细胞定位特征，以期为EHP 水通道蛋白的功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2021—2022 年在西南大学资源昆虫高效养殖与利用全国重点实验室开展。供试的感染EHP 与未感染EHP 的凡纳滨对虾均购自重庆市合川区和铜梁区的养殖池塘，新西兰实验兔购自重庆恩斯维尔生物科技有限公司；大肠杆菌Escherichia coliDH5α 和Rosetta 感受态细胞购自重庆灵精生物科技有限公司，pCold-TF 表达质粒由本实验室保存；PrimeSTAR DNA 聚合酶、XhoI 和PstI 限制性内切酶、IPTG、脱脂奶粉购自Takara Bio 公司，425-600 μm 玻璃珠、弗氏佐剂、DAPI 细胞核染料、HRP 标记山羊抗兔IgG、Triton X-100购自Sigma-Aldrich公司，Alexa Fluor®594 山羊抗兔荧光二抗购自Invitrogen 公司，TF-tag 兔多克隆抗体购自迅检（重庆）生命科技有限责任公司；DNA 胶回收试剂盒、Total RNA提取试剂盒、质粒抽提试剂盒购自Omega Bio-Tek 公司，一步法快速克隆试剂盒购自上海翊圣生物公司；PMSF、考马斯亮蓝染色液、Wheat Germ Agglutinin（WGA-488）购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计与合成 根据虾肝肠胞虫水通道蛋白编码基因EHP00_492序列（GenBank No.MNPJ01000023.1: 89 904～90 632，729 bp），使用Primer 5.0 软件设计特异性引物。用于RT-PCR 的引物对，EHP00_492-F1序列：5′-ATGCAAGTCAGTAAAAAATTAATAG-3′，EHP00_492-R1 序列：5′-TTATTTAAACAACAAAA ATACTTG-3′；用于克隆的引物对，EHP00_492-F2 序列：5′-GGCATATGGAGCTCGGTACCCTCGAG ATGCAAGTCAGTAAAAAATTAATAG-3′（下划线为XhoI 酶切位点），EHP00_492-R2序列：5′-GCAGAGATTACCTATCTAGACTGCAGTTATTT AAACAACAAAAATACTTG-3′（下划线为PstI 酶切位点）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 RNA 提取和RT-PCR 采用RT-PCR 方法克 隆EHP00_492基因。取 约1×106个EHP 孢子，按照RNA 提取试剂盒说明书提取RNA，并利用逆转录试剂盒将总RNA 逆转录为cDNA。以cDNA 为模板、EHP00_492-F1/R1 为引物，通过PCR 扩增EHP00_492基因。PCR 反应体系：PrimerSTAR DNA（2×）聚合酶 25 μL，引物 0.2 μmol/L，cDNA 1 μL，ddH2O 补足至50 μL。PCR反应条件：98 ℃ 3 min；98 ℃ 20 s、50 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s，35 个循环；72 ℃ 10 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR 产物，并送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.2.3 生物信息学分析 通过NCBI（http://ncbi.nlm.nih.gov/）完成序列检索并利用微孢子虫数据库（https://microsporidiadb.org/micro/app/）进行基因座位分析；利用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）进行分子量、氨基酸数量和等电点等特征预测；利用SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行蛋白信号肽预测；利用NetPhos 3.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）进行蛋白潜在磷酸化位点预测；利用PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）进行蛋白二级结构预测；利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）进行蛋白质功能域预测；利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）进 行跨膜结构域预测；利用MAFFT（https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/index.html）进行微孢子虫与不同物种之间水通道蛋白的多重序列比对；利用AlphaFold 软件进行蛋白质三维结构预测与比对；利用MEGA 7.0 软件基于Neighbor-Joining 法构建系统发育树。

1.2.4EHP00_492重组质粒构建 将pCold-TF载体质粒进行XhoI 和PstI 双酶切，酶切反应体系：限制性内切酶各3.5 μL，CutSmart buffer 5 μL，模板1～5 μg，ddH2O 补足至50 μL。酶切反应条件：37 ℃下孵育20 min。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳并割胶回收。使用EHP00_492-F2/R2 引物扩增EHP00_492片段，反应体系：PrimerSTAR DNA 聚合酶 25 μL，引物 0.2 μmol/L，模板1 μL，ddH2O 补足至50 μL。反应条件：98 ℃ 3 min；98 ℃ 20 s、50 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s，35 个循环；72 ℃ 10 min，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并割胶回收。根据一步法克隆试剂盒的操作说明将4 μL 载体与6 μL 外源片段进行连接，连接酶10 μL，50 ℃孵育20 min。将连接产物转化至E.coliDH5α 感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB 培养基过夜培养。挑取单菌落提取质粒进行PCR 和双酶切验证，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.5 EHP00_492 异源蛋白表达、纯化及其兔多克隆抗体制备 将测序正确的pCold-TFEHP00_492重组质粒转化至表达菌株E.coliRosetta 中，添 加0.5 mmol/L IPTG诱导，收 集菌体进行破碎，使用Ni-NTA 亲和层析柱纯化rEHP00_492 重组蛋白。纯化后的rEHP00_492 蛋白与佐剂混合后免疫新西兰实验兔，制备兔多克隆抗体。

1.2.6 EHP 孢子总蛋白提取 取约1×106个EHP成熟孢子，加入1×PBS 300 μL、PMSF 20 μL 和425～600 μm玻璃珠0.4 g混合进行破碎，破碎条件：6 m/s，30 s/轮，6 轮/次，每轮间歇10 s，共破碎3 次。离心后的上清即为EHP 孢子总蛋白。

1.2.7 蛋白免疫印记（Western blot）将EHP 孢子总蛋白进行SDS-PAGE 电泳后，电转至PVDF膜。将PVDF 膜于37 ℃下封闭1～2 h；分别利用EHP00_492 兔多克隆抗体和TF-tag 兔多克隆抗体室温下孵育PVDF 膜1 h，利用羊抗兔IgG 二抗室温下孵育PVDF 膜45 min。采用化学发光成像仪（Azure Biosystems C300）对PVDF膜进行曝光、成像。

1.2.8 间接免疫荧光实验（Indirect immunofluorescence assay，IFA）将EHP 孢子涂布于包被0.01%（V/V）多聚赖氨酸的载玻片上，滴加4%（V/V）多聚甲醛固定样品，加入1%（V/V）Triton X-100 处理20 min；加入IFA 封闭液于室温下孵育1 h，分别加入EHP00_492 兔多克隆抗体和TF-tag 兔多克隆抗体于室温下孵育1 h，加入Alexa Fluor®594山羊抗兔荧光二抗于室温下避光孵育1 h；加入DAPI 和Wheat Germ Agglutinin（WGA-488）于室温下避光染色20 min，使用激光共聚焦显微镜（OLYMPUS FV1000）观察结果。

2 结果与分析

2.1 EHP00_492 基因座位保守性分析

通过6 种微孢子虫同源基因座位保守性分析发现，虾肝肠胞虫EHP00_492与毕氏肠胞虫EBI_27080、黄道蟹微孢子虫ECANGBI_2177、兔脑炎微孢子虫ECU07_0740、肠脑炎微孢子虫Eint_070680和海伦脑炎微孢子虫EHEL_070710同源基因及其邻近基因座位相当保守（图1），推测这些基因行使相似且保守的功能。兔脑炎微孢子虫ECU07_0740 已被鉴定具有水通道蛋白的功能［18］，推测EHP00_492是虾肝肠胞虫水通道蛋白编码基因。

图1 EHP00_492 同源基因座位保守性分析Fig. 1 Conservation analysis of EHP00_492 homologous gene locus

2.2 EHP00_492 基因克隆

提取EHP 总RNA，反转录cDNA，以cDNA为模板，采用EHP00_492-F1/R1 引物进行RTPCR 扩增。电泳结果（图2）显示，约750 bp 处有1 条特异性扩增条带；经测序可知，RT-PCR扩增条带的序列与EHP00_492全长序列一致，表明该基因无内含子。

2.3 EHP00_492 序列特征

EHP00_492 含有242 个氨基酸，预测分子量为25 kD。经预测EHP00_492 无信号肽，但具有多个丝氨酸和苏氨酸磷酸化修饰位点。利用PSIPRED 对EHP00_492 的二级结构进行分析，结果（图3）表明该蛋白具有8 个α 螺旋和多个无规则卷曲。TMHMM 分析发现，EHP00_492 中12～31 aa、41～60 aa、91～113 aa、133～155 aa、176～198 aa、218～240 aa 的位置存在6 个跨膜结构域（图4）。SMART 预测结果（图5）显示，EHP00_492 含有1 个保守的水通道蛋白家族结构域（2～236 aa）。比较EHP00_492 与不同微孢子虫同源蛋白发现，它们都富含亮氨酸，等电点偏酸性，均含有6～8 个跨膜结构域（表1）。

表1 EHP00_492 同源蛋白序列特征比较Table 1 Comparison sequence characteristics of EHP00_492 and homologous proteins

图3 EHP00_492 二级结构特征分析Fig. 3 Analysis of the secondary structure of EHP00_492

图4 EHP00_492 跨膜域预测Fig. 4 Prediction for the transmembrane domain of EHP00_492

图5 EHP00_492 功能结构域分析Fig. 5 Analysis of the function domain of EHP00_492

2.4 EHP00_492 序列保守性与同源蛋白亲缘进化关系分析

BlastP 比对结果（图6）发现，EHP00_492与毕氏肠胞虫EBI_27080 序列相似性最高，为74%；与兔脑炎微孢子虫ECU07_0740、海伦脑炎微孢子虫EHEL_070710、肠脑炎微孢子虫Eint_070680 序列相似性介于46%～48%之间；多重序列比对发现，EHP00_492 与其他同源蛋白均存在2 个水通道蛋白的保守基序NPA/G，分别位于69～71 aa 和201～203 aa 处，且呈对称分布。系统进化树分析结果（图7）发现，EHP00_492 与毕氏肠胞虫水通道蛋白EBI_27080 聚为一支；相比于人水通道蛋白NP932766.1 和对虾水通道蛋白ROT75608.1，微孢子虫来源的水通道蛋白与酵母水通道蛋白ADC55558.1 的进化关系更近。

图6 EHP00_492 同源序列比对Fig. 6 Alignment analysis of EHP00_492 and homologous sequences

图7 EHP00_492 系统进化树分析Fig. 7 Phylogenetic tree analysis of EHP00_492

2.5 EHP00_492 蛋白三维结构预测

利用AlphaFold 软件预测EHP00_492 蛋白的三维结构（图8），并与已完成功能鉴定的

图8 EHP00_492 与NbAQP 和EcAQP 三维结构比对Fig. 8 Comparison the three-dimensional structure of EHP00_492,NbAQP and EcAQP

家蚕微粒子虫水通道蛋白NbAQP（GenBank No.NBO_16g0013）和兔脑炎微孢子虫水通道蛋白EcAQP（GenBank No.ECU07_0740）的三维结构比对，发现3 个蛋白质在10～32 aa、42～126 aa、129～160 aa、172～242 aa 处存在重叠，暗示其蛋白功能的保守性。

2.6 EHP00_492 蛋白的表达特征

将pCold-TF-EHP00_492重组表达质粒转化E.coliRosetta 菌株中，IPTG 诱导后获得大量rEHP00_492 重组蛋白，利用Ni-NTA 亲和层析柱纯化后，SDS-PAGE 检测发现100 mmol/L 咪唑能纯化出质量较高的rEHP00_492 重组蛋白，分子量大小约为75 kD，与预测分子量大小一致（图9 A）。将rEHP00_492 重组蛋白免疫新西兰实验兔制备EHP00_492 兔多克隆抗体。通过蛋白免疫印记分析EHP00_492 在EHP 中的表达特征，结果（图9 B）显示，与阴性对照pCold-TF 抗体相比，EHP00_492 兔多克隆抗体可在EHP 天然总蛋白中识别1 条大小约21 kD 的条带，表明EHP00_492在EHP 中能表达，其分子量大小为21 kD。

图9 EHP00_492 蛋白的纯化与表达特征Fig. 9 Purification and expression characteristics of EHP00_492

2.7 EHP00_492 亚细胞定位特征

为进一步分析EHP00_492 的亚细胞定位特征，利用麦胚芽凝集素WGA-488 特异性标记EHP 成熟孢子孢壁上的几丁质，结果（图10）发现，与对照组相比，红色荧光标记的EHP00_492兔多克隆抗体能特异性识别EHP 成熟孢子中的EHP00_492 蛋白，并且红色荧光信号与绿色荧光标记的WGA-488 信号存在共定位现象，表明EHP00_492 蛋白定位于EHP 成熟孢子的孢壁上。

图10 IFA 分析EHP00_492 在EHP 成熟孢子中的亚细胞定位特征Fig. 10 Subcellular location characteristics of EHP00_492 in EHP mature spores by IFA

3 讨论

2004 年以来，EHP 相继在泰国、中国、印度、印度尼西亚和委内瑞拉等对虾养殖大国被发现，由于其具有快速水平传播和垂直传播的能力，给全球对虾养殖生产造成了严重经济损失［21］。微孢子虫具有一个特殊的侵染装置，由极管、极膜层和后极泡3 部分组成［22-23］。特定环境刺激孢子发芽，极管从成熟孢子内部迅速弹出并刺入宿主细胞，将具有病原性的孢原质运送至宿主细胞完成侵染［24-25］。因此，发芽是微孢子虫成功感染宿主的关键。

研究发现，微孢子虫内外渗透压的瞬间变化激活了孢子发芽，在此过程中，水通道蛋白发挥重要作用［26］。水通道蛋白属于MIP 蛋白超家族，可选择性地将水、中性小分子和离子进行跨膜运输。MIP 超家族分为水通道蛋白（AQPs）和甘油摄取促进剂（GlpFs）两大类，前者存在于所有生命，后者多来源于微生物［27］。作为第一亚家族，AQPs 是水选择透性的水通道蛋白，包括AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP5 和AQP6。第二亚家族GlpFs 既能渗透水，也能运输其他不带电的小分子（如氨、尿素和甘油等）。根据氨基酸序列特征，AQP3、AQP7、AQP9 和AQP10 归属于这一家族［28-29］。原核生物的水通道蛋白首次发现于大肠杆菌，水通道蛋白AqpZ 介导水的快速流入或流出以应对大肠杆菌细胞外渗透压变化，此外，AqpZ 还有助于大肠杆菌细胞体积的增长［27］。酿酒酵母含有4 个水通道蛋白基因，分别为AQY1、AQY2、AQY3和Fps1。低温使酿酒酵母细胞膜的流动性和渗透性降低，但水通道蛋白AQY1 能加速胞内水的流出，避免细胞死亡［30］。水通道蛋白参与了细胞膜的渗透调节。微孢子虫也具有水通道蛋白，当其发芽激活时，水通道蛋白促进水分子迅速流入孢子内部，造成后极泡和极膜层瞬间膨胀，直至孢子前端破裂，极管被膨胀的后极泡推动并外翻弹出。此外，氯化汞能抑制水通道蛋白功能，但无法抑制EcAQP 对水的渗透，推测EcAQP 缺乏位于NPA 保守基序旁对汞敏感的半胱氨酸位点。虾肝肠胞虫作为养殖对虾检出率最高的病原之一，目前暂无有效防治药物。因此，后续研究工作可探索靶向EHP00_492 的抑制剂降低孢子发芽，以期有效控制EHP 传播。

4 结论

本研究从虾肝肠胞虫基因组中筛选到水通道蛋白编码基因EHP00_492，序列分析发现EHP00_492 符合水通道蛋白保守的序列特征。系统进化树分析发现，EHP00_492 与毕氏肠胞虫水通道蛋白EBI_27080 亲缘关系最近，并且与已鉴定的家蚕微孢子虫水通道蛋白NbAQP、兔脑炎微孢子虫水通道蛋白EcAQP 的三维结构高度相似。EHP00_492 能表达定位于虾肝肠胞虫成熟孢子的孢壁上，推测其在EHP 发芽过程中发挥重要功能。本研究初步明确了EHP00_492 蛋白的序列特征、结构特征和表达定位特征，对进一步探究EHP 水通道蛋白的功能具有重要意义。