彭 凯，邱建强,2，徐友良，黄文庆，王玉玺，黄 文

（1.广东省农业科学院动物科学研究所/农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室/广东省农业科学院水产研究中心/广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东 广州 510640；2.华中农业大学水产学院，湖北 武汉 430070；3.肇庆市佰仕科生物科技有限公司，广东 肇庆 526105；4.广州飞禧特生物科技有限公司，广东 广州 510640；5.加拿大农业与农业食品部莱斯布里奇研究中心，阿尔伯塔 莱斯布里奇 T1J4B1）

【研究意义】缩合单宁是由黄烷-3-醇或黄烷3,4-二醇单体聚合而成的多酚类化合物，其广泛存在于植物界，是一类化学结构和生物活性特殊的植物次级代谢产物［1］。由于高剂量缩合单宁阻碍动物对营养物质的有效利用，甚至造成机体代谢紊乱、器官损伤，因此，长期以来缩合单宁被视为“抗营养因子”［2］。但近年来研究发现，低剂量缩合单宁具有促进动物健康的潜在应用价值［3］，归因于低剂量缩合单宁所表现的抑菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、促进糖脂代谢等生物活性。后抗生素时代，植物提取物缩合单宁的生物活性逐渐受到广泛关注，适量缩合单宁不仅不影响动物的生长性能，还能发挥抗氧化、免疫调节、降脂、调节肠道微生态等功效，具有良好的“替抗”应用前景［3］。因此，开展缩合单宁饲料添加剂应用研究对提升养殖动物的健康和品质具有现实意义。

【前人研究进展】目前缩合单宁在动物生产上的研究主要集中于畜禽动物，其作为水产饲料添加剂的研究虽然不多，但已有研究表明，缩合单宁在草鱼［4-5］、中国花鲈［6-10］、日本花鲈［11-14］、凡纳滨对虾［15-16］上表现出抗氧化、抗炎、调节肠道微生态平衡等积极作用。肝脏是鱼类重要的代谢器官和免疫器官，也是维持鱼类生理机能最核心的器官之一，因此肝脏健康对鱼类生长和抗逆至关重要。适量缩合单宁还能降低草鱼［5］和美洲鳗鲡［17］的肝脏脂肪水平，维持肝脏健康。【本研究切入点】大口黑鲈（Micropterus salmoides），又名加州鲈，属于典型的肉食性鱼类，因其生长快、骨刺少、营养美味、养殖经济效益高而深受市场和消费者青睐。据中国渔业统计年鉴数据显示，2022 年我国淡水养殖的大口黑鲈产量高达70 万t［18］，在我国淡水渔业发展中起重要支撑作用。然而，高密度养殖模式下出现的大口黑鲈代谢紊乱、口感油腻、病害频发等问题亟待解决。此外，由于饲养不当容易导致“脂肪肝”问题（大多在养殖中后期的大规格大口黑鲈中出现），这不仅不利于大口黑鲈的生存和健康，还将导致鱼肉品质降低［19］，使养殖蒙受经济损失。目前，缩合单宁应用于缓解大规格大口黑鲈“脂肪肝”以及促进动物肝脏健康的研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】本试验通过在大口黑鲈饲料中添加0.1%、0.2%和0.4%的缩合单宁，探究缩合单宁的适宜添加量及其对大规格大口黑鲈生长性能、血清代谢物、肝脏组织结构及脂肪含量的影响，旨在为缩合单宁在大口黑鲈饲料中的应用以及大口黑鲈健康养殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验于2022 年10—11 月在广东省农业科学院白云区农业科学试验中心的池塘网箱养殖系统中进行。供试的大规格大口黑鲈购于佛山市顺锋渔联水产有限公司，于网箱中暂养2 周以适应养殖环境，暂养期间投喂商品饲料（购于佛山市南海区杰大饲料有限公司）。本试验采用的缩合单宁来源于葡萄籽（纯度≥95%），购于肇庆市佰仕科生物科技有限公司。

1.2 饲料配制

基础饲料（G1）的原料组成及实测营养水平见表1。在G1 基础上分别添加0.1%（G2）、0.2%（G3）和0.4%（G4）的缩合单宁配制试验饲料。全部饲料原料粉碎过孔径250 μm 的标准筛，维生素和矿物质预混料等微量组分采用逐级扩大法混匀，缩合单宁经蒸馏水溶解后直接添加到原料中。全部饲料原料经混合机混匀，采用SLX-80型双螺杆挤压膨化机制成膨化颗粒饲料（直径2 mm），经55 ℃烘干后冷却至室温，装入密封袋中，于-20 ℃冰箱中保存备用。

表1 基础饲料组成及营养水平（干物质基础）Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(Dry matter basis)

1.3 试验设计与饲养管理

暂养结束后，选取初体重为510（± 10.4）g 的大规格大口黑鲈600 尾，随机分为4 组，每组3 个网箱（长1.5 m×宽1.5 m×高3 m），每个网箱50 尾鱼。分别投喂1.2 的4 种饲料，采用饱食投喂方法，每天定时投喂2 次（8：00 和18：00），记录水温、水质、投喂量和死亡情况，试验周期为30 d。试验期间水温为26（± 3）℃，pH 7.6～8.0，氨氮含量≤0.1 mg/L，亚硝酸盐含量≤0.01 mg/L，溶氧含量＞5.0 mg/L。

1.4 样品采集与分析

1.4.1 生长性能指标测定 试验结束前24 h禁食，统计每个网箱中大口黑鲈的总数量和总体重，计算存活率、增重率、特定生长率、采食量和饲料系数。每缸随机取3 尾鱼，解剖并分离腹腔内的脂肪进行称重，计算腹脂率。

存活率（%）=100×末尾数/初始尾数；

增重率（%）=100×（末体重-初始体重）/初始体重；

特定生长率（%/d）=100×（ln 末体体重-ln初始体重）/饲养天数；

采食量（g/尾）=摄食饲料总量/〔(初始尾数+终末尾数)/2〕；

饲料系数=摄食饲料总量/（末体重-初始体重）；

腹脂率（%）=100×腹腔脂肪总量/末体重。

1.4.2 血清代谢物测定 从每个网箱随机取10 尾鱼，用40 mg/L 间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MS-222）麻醉，于尾静脉处采集血液，室温下静置2 h 后离心（3 500 r/min，10 min）制备血清，置于-20 ℃冰箱中保存，用于血清代谢物分析。血清代谢物如白蛋白、球蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇等采用全自动生化分析仪（日立7600，日本）测定。

1.4.3 肝脏组织结构观测 从每个网箱随机取6尾鱼，解剖取肝脏组织，先用数码相机拍照，随后将肝脏组织完全浸没于4%多聚甲醛溶液中，放置48 h 进行组织固定，制作石蜡切片，采用H&E 染色法染色，于显微镜下拍照并观察肝脏的组织形态。

1.4.4 肝脏脂肪含量测定 从每个网箱随机取6尾鱼，解剖取肝脏组织并完全浸没于4%多聚甲醛溶液中，放置48 h 进行组织固定，然后脱水、石蜡包埋、切片（厚度8 μm）、油红O 染色、拍照，用于肝脏中脂滴面积比的分析。从每个网箱另取6 尾鱼，解剖取肝脏组织，采用乙醚抽提法（GB/T 6432-2006）分析肝脏粗脂肪含量。

1.5 数据统计与分析

采用SPSS 17.0 统计软件中的单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan氏法均值多重比较法对试验结果的差异显著性进行分析，若不满足方差齐性则采用Dunnett-T3 检验法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 饲料中添加缩合单宁对大规格大口黑鲈生长性能的影响

饲料中添加缩合单宁对大规格大口黑鲈生长性能的影响如图1 所示。各组之间大口黑鲈的采食量、增重率和特定生长率无显著差异。与G1组相比，G2 和G3 组存活率无显著差异，G4 组存活率显著下降15.79%（P＜0.05）；G2、G3、G4 组腹脂率显著下降12.03%、16.18%、13.69%（P＜0.05）；G2、G3 组饲料系数无显著差异，G4 组饲料系数显著升高17.44%（P＜0.05）。

图1 饲料中添加缩合单宁对大规格大口黑鲈生长性能的影响Fig. 1 Effects of dietary condensed tannins on growth performance of large-sized Micropterus salmoides

2.2 饲料中添加缩合单宁对大规格大口黑鲈血清代谢物的影响

饲料中添加缩合单宁对大规格大口黑鲈血清代谢物的影响如表2 所示。各组之间大口黑鲈的血清白蛋白、球蛋白、高密度脂蛋白胆固醇的含量及谷丙转氨酶、谷草转氨酶的活性无显著差异。与G1 组相比，G2、G3 组血清葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯含量无显著差异，而G4 组血清葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯含量则分别显著下降49.73%、28.46%、35.71%（P＜0.05）；G2 组血清低密度脂蛋白胆固醇含量无显著差异，G3、G4 组血清低密度脂蛋白胆固醇含量分别显著下降38.71%、51.61%（P＜0.05）。

表2 饲料中添加缩合单宁对大规格大口黑鲈血清代谢物的影响Table 2 Effects of dietary condensed tannins on serum metabolites of large-sized Micropterus salmoides

2.3 饲料中添加缩合单宁对大规格大口黑鲈肝脏表观形态和组织结构的影响

饲料中添加缩合单宁对大规格大口黑鲈肝脏表观形态和组织结构的影响分别如图2 和图3 所示。由图2 可见，G1 和G2 组大口黑鲈的肝脏呈现不同程度的“花肝”现象，G3 和G4 组肝脏颜色鲜红、形态正常。图3 显示G1 组肝细胞空泡化程度高，局部出现炎症浸润现象；G2 组肝细胞有轻微的空泡化现象，局部出现炎症浸润；G3和G4 组肝细胞形态结构正常，未见明显的炎症浸润。

图2 饲料中添加缩合单宁对大规格大口黑鲈肝脏表观形态的影响Fig. 2 Effects of dietary condensed tannins on the livermorphology of large-sized Micropterus salmoides

图3 饲料中添加缩合单宁对大规格大口黑鲈肝脏组织结构的影响（H&E 染色，× 200）Fig. 3 Effects of dietary condensed tannins on liver histomorphology of large-sized Micropterus salmoides(H&E staining,× 200)

2.4 饲料中添加缩合单宁对大规格大口黑鲈肝脏脂肪含量的影响

饲料中添加缩合单宁对大规格大口黑鲈肝脏脂肪分布、脂肪含量及脂滴面积比的影响分别如图4 和图5 所示。由图4 可见，肝脏经染色后脂质呈红色，细胞核呈蓝色，随着饲料中缩合单宁含量的增加，肝脏中代表脂质的染色面积显著降低。与G1 相比，G2、G3 和G4 组大口黑鲈的肝脏脂肪含量分别显著降低9.52%、10.84%、11.25%（P＜0.05），G3 和G4 组肝脏脂肪含量分别显著低于G2 组1.45%、1.91%（P＜0.05）；大口黑鲈肝脏脂滴面积比由大到小依次为G1（4.32%）＞ G2（0.76%）＞ G3（0.57%）＞ G4（0.20%）（P＜0.05）（图5）。

图4 饲料中添加缩合单宁对大规格大口黑鲈肝脏脂肪分布的影响（油红O 染色，× 200）Fig. 4 Effects of dietary condensed tannins on liver lipid distribution of large-sized Micropterus salmoides(Oil red O staining,× 200)

图5 饲料中添加缩合单宁对大规格大口黑鲈肝脏脂肪含量和脂滴面积比的影响Fig. 5 Effects of dietary condensed tannins on liver fat content and lipid droplet area ratio of large-sized Micropterus salmoides

3 讨论

3.1 饲料中添加缩合单宁对大规格大口黑鲈生长性能的影响

缩合单宁属于天然多酚类化合物，作为功能性饲料添加剂仅在草鱼［4-5］、中国花鲈［6-10］、日本花鲈［11-14］、凡纳滨对虾［15-16］、美洲鳗鲡［17］等少数水产动物品种上有相关研究，其对水产动物生长和健康影响的研究仍相当缺乏。本研究结果表明，各组之间大口黑鲈的采食量、增重率和特定生长率均无显著差异，说明饲料中添加0.1%～0.4%缩合单宁不影响饲料的适口性，也不会对大口黑鲈的生长速率造成负面影响。0.1%和0.2%缩合单宁对大口黑鲈的存活率和饲料系数无显著影响，表明适量的缩合单宁（0.1%、0.2%）并不影响大口黑鲈的存活与饲料转化效率，而0.4%剂量组大口黑鲈的饲料系数显著下降，可能与高剂量缩合单宁的抗营养特性有关。高剂量缩合单宁被视为“抗营养因子”［1］，归因于缩合单宁具有较强的蛋白质结合能力，亦可与消化酶、碳水化合物、矿物质结合形成复合物，从而阻碍营养物质的消化和利用［20］。本试验结果与缩合单宁在花鲈［6］上的研究结果一致，即低剂量缩合单宁不影响成活率和饲料系数，而高剂量缩合单宁抑制饲料养分的消化和吸收，损伤肠道组织。海鲈［14］相关研究也表明，低剂量的葡萄籽缩合单宁不影响海鲈的生长性能和肠道组织结构，但高剂量缩合单宁造成肠道胰蛋白酶和刷状缘酶的活性下降。本试验中，0.4%剂量组大口黑鲈存活率显著下降可能归因于高剂量缩合单宁对机体造成损伤，已有研究表明高剂量缩合单宁不仅可显著破坏草鱼［4］、花鲈［6,10］、凡纳滨对虾［16］肠道组织结构，还可通过其代谢产物进入血液循环损害机体其他器官［21］。

3.2 饲料中添加缩合单宁对大规格大口黑鲈血清代谢物的影响

血液代谢物水平可间接反映鱼体的健康状况。本研究结果表明，大口黑鲈血清葡萄糖、胆固醇及甘油三酯的含量随着缩合单宁添加量的升高而下降，并在0.4%剂量时差异显著，说明高剂量缩合单宁具有促进糖脂代谢的效果。这与缩合单宁应用于花鲈［7］上的研究结果一致，即0.1%、0.2%缩合单宁可促进花鲈血清糖脂代谢。低密度脂蛋白胆固醇的作用是将肝脏合成的内源性胆固醇运输到肝外组织（如转移至血液），而本研究中大口黑鲈血清低密度脂蛋白胆固醇含量随着缩合单宁剂量的升高而降低，并在0.2%剂量时差异显著，说明缩合单宁可能抑制了胆固醇由肝脏向血液转移，从而导致血清中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的含量下降。此外，除血清糖脂含量降低外，腹脂率和肝脂含量也显著降低。缩合单宁添加组大口黑鲈的腹脂率均显著降低，肝脏油红O 染色结果也说明缩合单宁可显著降低肝脏脂滴面积比，缓解大口黑鲈的“脂肪肝”现象，上述结果说明饲料中添加适量的缩合单宁对促进大口黑鲈糖脂代谢具有积极作用。相关研究表明，缩合单宁能够促进水产动物的糖脂代谢，如低于2 g/kg 的缩合单宁可促进中国花鲈的糖脂代谢［7］，饲料中添加0.1%缩合单宁可改善海鲈由高碳水化合物引起的生长性能下降及血糖水平升高，归因于缩合单宁对海鲈肝脏糖代谢相关酶（如葡萄糖激酶、丙酮酸激酶）活性及基因表达的促进作用［11］。体外研究发现，缩合单宁可通过离子相互作用、疏水相互作用和分子间氢键直接与胆固醇结合，且其结合能力随缩合单宁的浓度升高而增强［22］。另有研究指出，缩合单宁还可通过与脂肪酶、胆固醇酯酶、胆汁酸的相互作用来减少脂质的消化［23-24］。Oliveira 等［25］发现，缩合单宁除了通过抑制α-淀粉酶阻碍葡萄糖吸收外，还能通过抑制胰脂肪酶从而间接抑制甘油三酯的吸收。综上，一方面缩合单宁可影响糖脂的消化和吸收进程，从而降低机体对糖脂的摄入量；另一方面缩合单宁可介导糖脂代谢途径、相关酶活性及基因表达，从而促进糖脂分解代谢并降低血液中的糖脂水平。

3.3 饲料中添加缩合单宁对大规格大口黑鲈肝脏组织结构和脂肪含量的影响

组织结构观察能够直接反映动物器官的生理状态和健康程度，是判断组织器官是否发生病变的常用手段。本研究结果表明，饲料中添加缩合单宁有利于促进肝脏健康，缓解“花肝”现象。Kang 等［26］报道，饲料中添加高剂量缩合单宁对大口黑鲈的肝脏造成氧化损伤，并诱发炎症反应。与之相反，低剂量缩合单宁却表现出缓解氧化应激和炎症损伤的效应，这与本研究结果相一致，即随着缩合单宁添加量上升，大口黑鲈“花肝”问题得到改善，且肝脏的空泡化、炎症浸润现象也减弱。相似地，缩合单宁还可缓解海鲈黄曲霉毒素B1中毒［8］、高碳水化合物摄入［11］、铜离子应激［12］、缺氧胁迫［13］引起的氧化损伤，增强肝脏的抗氧化能力。本试验中缩合单宁改善大口黑鲈肝脏健康的原因可能是缩合单宁增强了肝脏的抗氧化功能，后续研究有待进一步证实。本试验结果表明，随着缩合单宁添加量的升高，大口黑鲈肝脏脂肪含量和脂滴面积比均显著下降，说明缩合单宁抑制了肝脏脂肪的沉积，其机制可能与缩合单宁调控脂代谢相关酶的活性、基因表达量及抑制脂肪细胞的生存有关。如顾艾鑫等［27］研究发现，缩合单宁通过下调脂肪酸合成酶和过氧化物酶体增殖剂激活受体PPAR γ 的基因表达水平，或者通过抑制Wnt3a/β-catenin 信号通路从而破坏脂肪细胞的增殖和分化，从而抑制脂肪合成。Han 等［28］报道，缩合单宁通过削弱胰岛素抵抗、抗氧化应激作用，使肠道微生态及屏障功能恢复正常，进而抑制肝炎及肝脏脂肪蓄积。相似地，缩合单宁对海鲈肝脏糖酵解和糖异生酶的活性及基因表达具有积极影响［11］。在陆生动物上，缩合单宁对高脂诱导的鼠表现出改善糖脂代谢的效果，且肝脏脂肪沉积下降［29-30］，这与本试验结果相一致。

4 结论

在本研究条件下，较高添加剂量（0.4%）缩合单宁导致大规格大口黑鲈存活率显著下降，且饲料系数显著升高，但促进糖脂代谢作用明显，腹脂率显著下降，血清葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯的含量及肝脏脂肪含量均显著下降。饲料中添加适量（0.1%和0.2%）缩合单宁对大规格大口黑鲈存活率、增重率、特定增长率和饲料系数无显著影响，但能降低腹脂和肝脂含量，其中以0.2%缩合单宁促进糖脂代谢作用效果较好。此外，随着缩合单宁添加量升高，大规格大口黑鲈肝脏健康问题逐渐改善，肝脏组织空泡化、炎症浸润现象减轻。以肝脏健康为评价依据，缩合单宁在大口黑鲈饲料中的适宜添加量为0.2%。