赵雯玮,达娃卓玛*,王珊珊,杨丽琼

(1.西藏自治区食品药品检验研究院,西藏 拉萨 850000;2.国家药品监督管理局中药(藏药)质量控制重点实验室,西藏 拉萨 850000)

赞丹杰巴丸又名八味檀香丸,为黄棕色至棕红色水丸,最早记载于《四部医典后续部》,为藏医常用经典名方,常被用于治疗肺结核等疾病。赞丹杰巴丸由檀香、紫檀、石灰华、红花、丁香、葡萄干、甘草、力嘎都、索罗等八种药材组成[1],具有清肺热、化脓血等功效,临床主要用于治疗肺热、肺脓肿、咯血、肺结核等疾病。该方剂药材选择和制备工艺根据藏医药学原理,选用珍稀、纯天然药材,采用现代科学技术与传统藏药加工技术相结合的方法精制而成。其中檀香用于治疗寒气凝滞、腹痛、胸痛;丁香用于治疗食欲不振、呕吐腹泻、脾胃虚寒、心腹冷痛[2];力嘎都用于医治气喘、咳痰、肺热咳嗽、咯血[2];红花用于医治痈肿;甘草用于医治咳嗽、咳痰、倦怠、乏力、脾胃虚弱、四肢痉挛疼痛等症[2];索罗用于医治感冒发热、肺热咳嗽等[3]。

赞丹杰巴丸标准收载于《卫生部颁藏药标准》(2005版)当中,但该标准仅收载制法、性状、检查(丸剂)、功效等项。与药材真伪、质量优劣紧密相关的显微鉴定、薄层色谱鉴别等项完全缺乏。赞丹杰巴丸作为临床常用制剂,含有贵重药材檀香、紫檀及矿物药石灰华,建立有效可控的质量标准,对保证临床用药安全具有重要意义。

本研究建立赞丹杰巴丸中檀香、紫檀、石灰华、红花、丁香的显微定性鉴别;建立以红花、丁香、甘草为主的薄层色谱(TLC)鉴别方法;同时开展石灰华化学反应鉴别及水分、重量差异等检测,为有效控制藏药赞丹杰巴丸质量提供技术支持。

1 材料与仪器

1.1 仪器

Scanner薄层点样和成像系统(CAMAG公司);KQ-500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);SENCOW201型恒温水浴锅(上海申生科技有限公司);BS-3000A电子天平(上海友声衡器有限公司);AL104型电子天平(梅特勒-托利多有限公司);日本奥林巴斯显微镜(C5060-ADU);薄层层析硅胶板(青岛海洋化工有限公司硅胶G板);双槽层析缸(上海信谊仪器厂有限公司)。

1.2 试药

红花对照药材(120907-201713)、丁香对照药材(121039-201405)和甘草对照药材(120904-202021)均采购于中国食品药品鉴定研究院,赞丹杰巴丸处方由西藏神猴药业有限责任公司提供,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。

1.3 样品信息

样品由以下4个厂家提供,具体信息见表1。

表1 赞丹杰巴丸样品信息

2 方法与结果

2.1 显微鉴别

取本品粉末少许,置于载玻片上,加水合氯醛封片,置于显微镜下观察,如图1所示。

注:1.檀香纤维束;2.紫檀纤维束;3.石灰华碳酸钙方晶;4.红花分泌细胞;5.红花花粉粒;6.丁香花粉粒。图1 赞丹杰巴丸粉末显微鉴别(10×40)

如图1所示,赞丹杰巴丸显微特征镜检时检出率较高,且特征专属性较强的部分。对4家企业提供的4批赞丹杰巴丸成药样品进行检验,显微鉴别结果经与参考文献[4-6]对比,发现赞丹杰巴丸共有鉴别特征有花粉粒呈圆形或类圆形,略带淡黄色,外壁被刺包裹,直径约60μm,含3个萌发孔,分泌细胞为长管状,其内含黄棕色至红棕色分泌物(红花)[4];木纤维束呈淡黄色,其周围含晶细胞壁厚,木化,层纹明显,内含草酸钙方晶,形成晶纤维,含晶细胞方形或长方形,壁厚,木化,层纹明显,胞腔含草酸钙方晶(檀香)[4];花粉粒呈无色或淡黄色,圆形或类圆形,直径约至16μm(丁香)[7];碳酸钙结晶呈短棒状或柱状,直径2～4μm,长65μm(石灰华)[8];棕红色木纤维成束或单个分散,部分纤维束周围含有草酸钙方晶,形成晶纤维,含晶细胞壁厚薄不均,且木化增厚,纹孔密集,纤维管胞呈红棕色,壁厚,壁上有具缘纹孔(紫檀)[9]。

2.2 理化鉴别

取2g赞丹杰巴丸,研磨后加入0.5mol/L稀盐酸试液20mL,充分震摇。过滤,取续滤液加入适量草酸铵溶液,分成两份等量试液,分别加入一定量的乙酸或盐酸溶液。结果如表2所示。

表2 赞丹杰巴丸理化鉴别结果

从上述结果可以看出,对赞丹杰巴丸中的主要药物石灰华(CaCO3),采用理化鉴别的方式可对其进行快速有效的鉴别。

2.3 薄层色谱鉴别方法的建立及应用

2.3.1 红花 (1)供试品及对照品溶液的制备。称取3g赞丹杰巴丸,研磨成粉,加入80%丙酮溶液10mL超声提取15min,静置后取上清液作为供试品溶液。分别精密称取0.5g红花对照药材和3g赞丹杰巴丸(去除红花),加入80%丙酮溶液(料液比1∶10),超声15min,放冷后取上清作为对照品溶液(红花)和阴性样品溶液。

(2)薄层色谱条件的筛选。展开剂的选择:采用2020版《中华人民共和国药典》[4]一部所收录红花项下薄层鉴别的方法条件。分别取样1号供试品溶液两份,阴性样品溶液一份、红花对照药材溶液一份,点样,以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)为展开剂展开。结果显示分离效果较差(其他成分干扰、拖尾)。故参考占堆等的方法[7],分别取等量1号供试品溶液、阴性样品溶液、对照品溶液(红花),进行点样,相继以乙酸乙酯-甲醇(6∶1)和乙酸乙酯-甲酸-水(9∶2∶2)为展开剂进行展开、取出、晾干后;结果显示采用占堆等[7]的展开条件分离效果最佳(斑点清晰),故以占堆等[7]的展开条件作为赞丹杰巴丸薄层鉴别的最佳展开条件。

(3)点样量考察。分别从1号供试品溶液、阴性样品溶液、对照品溶液(红花)各取1、4、7、10、15μL,点于同一硅胶G板上,按上述筛选出的最佳条件进行展开,观察发现点样量 10μL时斑点最清晰。故选择10μL为最佳的点样量。

(4)薄层板的选择。按上述筛选出的最佳条件取供试品溶液、阴性样品溶液、对照品溶液(红花)分别点于硅胶G、硅胶H、硅胶GF254板上,以上述最佳展开条件进行展开后,分别考察其在紫外、荧光及自然光下的分离度、拖尾情况、成点性,结果发现在硅胶G 板上的分离效果最好。故选择硅胶G板作为最佳的薄层板。

(5)赞丹杰巴丸中红花样品的鉴别。按上述筛选的最佳条件分别取等量样1～4供试品溶液、阴性样品溶液、对照品溶液(红花)各两份点样,以上述最佳展开条件展开,结果表明所有样品斑点清晰。红花药材溶液与4个待测样品中的特征斑点均清晰可见,但在阴性样品中没有出现该特征斑点。详见图2。

注:1-2:阴性样品;3-4:对照品(红花);5-6:样1;7-8:样2;9-10:样3;11-12:样4展开剂:先用乙酸乙酯-甲醇(6∶1)为展开剂,展开,取出,挥干,再用乙酸乙酯-甲酸-水(9∶2∶2)展开(青岛硅胶G板,12.6℃,17%)。图2 赞丹杰巴丸红花薄层色谱

2.3.2 丁香 (1)供试品及对照品溶液的制备。分别称取2g赞丹杰巴丸、0.5g丁香药材和2g赞丹杰巴丸(去除丁香),研磨后按1∶10的料液比加入乙醇,超声20min,过滤,取滤液作为供试品溶液、对照品溶液(丁香)和阴性样品溶液。

(2)薄层色谱条件的筛选。①展开剂及展开条件的选择:分别取10μL阴性样品溶液、对照品溶液(丁香)及1号供试品溶液点于同一硅胶G板上,以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.5)[7]为展开条件,分别横向、竖向展开,取出挥干后以5%硫酸香草醛溶液显色。发现横向展开时干扰严重,分离效果较差;改为使用竖向展开时,分离效果佳,但斑点易出现弧形、弯曲状。经改良后采用双槽层析缸展开,先在层析缸一边槽内放入展开剂,另一边槽内放入2mL纯化水,提前预饱和15min后再放入硅胶板,可有效避免弯曲现象。因此,采用预饱和的环己烷-乙酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.5)竖向展开为最佳展开条件。

②点样量的考察:分别取阴性样品溶液、对照品溶液(丁香)及1号供试品溶液1、3、5、7、9、11μL样品点于同一硅胶G板上,按上述确定的最佳展开条件展开,挥干,以5%香草醛硫酸溶液显色。发现点样量5μL时的分离效果和成点性最佳。故选择5μL为最佳点样量。

③不同薄层板的考察:按上述筛选的最佳条件,分别对阴性样品溶液、对照品溶液(丁香)及1号供试品溶液在硅胶G、硅胶H、硅胶GF254板上的分离情况进行考察。结果表明:硅胶G板的分离度最佳。

④不同显色剂的选择:按照上述筛选出的最佳条件进行点样、展开后,分别考察硫酸乙醇、5%香草醛硫酸溶液、紫外分光光度计、碘粉的显色情况,结果表明:用5%香草醛硫酸溶液时斑点颜色清晰。

(3)赞丹杰巴丸中丁香样品的鉴别。分别取阴性样品溶液、对照品溶液(丁香)、样1-4供试品溶液按上述筛选出的最佳条件进行点样、展开、显色。结果表明,薄层色谱图中待测斑点与其他成分分离效果佳良好,丁香的特征斑点在所有供试样品中可清晰检出,阴性样品未检出或不清晰,见图3。

注:1-2:样1;3-4:样2;5-6:样3;7-8:样4;9-10:阴性样品;11-12:丁香对照药材展开剂:环己烷-乙酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.5)(青岛硅胶G板,13.7℃,16%)。图3 赞丹杰巴丸丁香薄层色谱

2.3.3 甘草 (1)供试品及对照品溶液的制备。分别精密称取2g赞丹杰巴丸、0.5g甘草对照药材和赞丹杰巴丸(去除甘草),研磨后按1∶10的料液比加入乙醇,超声20min,取滤液浓缩至2mL,作为供试品溶液:对照品溶液(甘草)和阴性样品溶液。

(2)薄层色谱条件的筛选。于同一硅胶G板上分别点上5μL的1号供试品溶液、对照品溶液(甘草)、阴性样品溶液,以三氯甲烷-甲醇(9∶1)为展开系统展开,取出,挥干。置紫外灯(365nm)下检视。发现分离效果较优且斑点清晰;喷以10%硫酸乙醇,加热至斑点清晰时,各斑点清晰度和成点性、分离度均不佳。因此选择紫外灯(365nm)为赞丹杰巴丸最佳检视条件。

(3)赞丹杰巴丸中甘草的薄层色谱鉴别。按上述筛选的最佳条件于同一硅胶板分别点上1～4号供试品溶液、对照品溶液(甘草)、阴性样品供试品各两份,以上述最佳展开条件展开,置紫外灯(365nm)下检视,结果表明:在与对照品相对应的位置上,所有供试品均呈现界限清晰的斑点,且斑点的颜色是相同的。而在阴性样品相对应的位置上,没有斑点呈现。见图4。

注:1-2:阴性对照;3-4:甘草对照药材;5-6:样1;7-8:样2;9-10:样3;11-12:样4(青岛硅胶G板,13.7℃,16%)。图4 赞丹杰巴丸甘草薄层条件筛选

2.4 水分

根据《中华人民共和国药典》2020版[4]第四部通则0832水分(第二法)测定,每批样品各取3份测量水分,结果见表3,其水分平均含量为6.53%。

表3 赞丹杰巴丸水分测定结果 (%)

2.5 质量差异

根据《中华人民共和国药典》2020版[4]第四部通则0108丸剂项下质量差异测定,取20244批号样品以1丸为1份,取供试品10份,分别称定质量,再计算质量差异,结果见表4,质量差异符合药典规定。

表4 赞丹杰巴丸质量差异测定结果

3 讨论

在本研究中,通过显微、薄层色谱、化学鉴别、水分、质量差异五个方面对藏药赞丹杰巴丸的质量标准进行补充与完善。

在显微鉴别中,准确鉴定并描述赞丹杰巴丸中檀香纤维束、紫檀纤维束、石灰华碳酸钙方晶、红花分泌细胞、红花花粉粒及丁香花粉粒的形态特征,这些特征在所有供检样品中均容易发现,特征清晰,鉴别度高,具有很强的鉴别意义。

在薄层色谱鉴定中,通过对薄层板、展开剂、点样量、显色剂等多重因素考察,筛选并建立了可显著区别阴性对照品和供试品的红花、丁香、甘草的薄层色谱鉴定方法。这些方法选用的试剂具有低毒、廉价、溶剂易配制等特点,且该方法操作简便、结果直观,具有很好专属性,可以准确鉴别出是否含有红花、丁香、甘草等主要药材,可用于赞丹杰巴丸的真实性鉴定。

理化鉴别是生药鉴定中重要组成部分,可以根据中药中所含化学成分的理化性质,通过物理化学等分析方法,分析药物中某一类指标性成分的有无、多少等,是快速鉴定中药的真实性、纯度和品质优劣程度的一种鉴定方法。该方法具有操作简便、快速等优点。本文中,通过先后加入稀盐酸、氯化铵、草酸、稀盐酸等常规试剂的方法,快速鉴别了藏药赞丹杰巴丸中的石灰华的主要成分CaCO3。

同时根据《中华人民共和国药典》中检查项下的相关规定,测得赞丹杰巴丸的水分含量为6.75%～7.53%,平均水分含量为6.53%,质量差异为0.86%～3.91%,符合《中华人民共和国药典》规定的要求。

综上,本研究建立赞丹杰巴丸处方中的主要药材红花、丁香、甘草、檀香、紫檀、石灰华、红花、丁香等药材的显微鉴别、薄层色谱鉴别方法,并补充了水分、质量差异等检测项,规范和完善了赞丹杰巴丸的质量标准体系,为赞丹杰巴丸的规范化生产提供了简便可依的质量控制依据,为赞丹杰巴丸的临床用药的安全、稳定、有效提供科学保障。本研究建立的赞丹杰巴丸质量标准方法专属性强、重现性好,可用于其质量控制。