吴红旗,张钱钱,黄屹沅,支美汝,徐 蓉*

(1.泰州市中医院,江苏 泰州 225300;2.泰州市药品检验院,江苏 泰州 225300)

中药炭药是指在中医药理论指导下,对中药进行加工炮制,使中药表面变为黑色,内部仍保存部分原药材颜色,并且具有一定特殊临床疗效的一类药物,是自古以来中医临床应用最具特色的药物之一[1]。历代医家十分重视炭药的止血作用,并逐渐形成了以治疗出血性疾病为主的独特炭药理论——“炒炭止血”[2]。中药制炭讲究“炒炭存性”,即中药经炒炭后,使其表面呈现黑色、部分炭化,且不能使整个中药完全炭化,更不能使其完全灰化,未炭化的部分仍应可以闻到原药材原来的气味;部分中药经炭制后,如茜草炭等,其原有性状仍易被辨认[3]。

牡丹皮炭为毛茛科植物牡丹的干燥根皮炮制加工品[4],外表黑褐色,内部棕黄色,牡丹皮经炭制后止血功效增强,用于吐血、衄血等;黄芩为唇形科植物黄芩干燥根的加工品,外表皮黑褐色或焦黑色,炭制后其止血作用增强[5],用于治疗肺热咳嗽、高热烦渴、胎动不安等。

自药品标准建立以来,在《中华人民共和国药典》《地方中药材标准》中炭类药项下,均未要求检查浸出物含量。2020年版《江苏省中药饮片炮制规范》牡丹皮炭与黄芩炭项下规定,牡丹皮炭浸出物≥12.0%;黄芩炭≥33.0%。大工艺生产炮制炭药时,既要求性状符合规定,同时其浸出物含量也需符合规定。但在实际生产中往往二者不能同时兼顾,即在性状符合标准时,浸出物含量往往不符合规定。故本研究拟采用正交实验法,探索牡丹皮炭与黄芩炭的最佳炮制工艺,为工业化生产提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BT125D十万分之一分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司);FA2004万分之一分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司);AP-01P真空泵(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);GKC数显智能型恒温水浴锅(上海波络实验设备有限公司);Uitimate3000高效液相色谱仪(赛默飞);YFR-3503电磁炉(佛山市俏厨电器有限公司);KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);IC101电热鼓风干燥箱(南通仪器嘉程有限公司)。

1.2 试剂及药材

95%乙醇(上海凌峰化学试剂有限公司;分析纯AR);磷酸(国药集团化学试剂有限公司,优级纯 GR);甲苯(上海凌峰化学试剂有限公司;分析纯AR);稀乙醇、70%乙醇、0.1%磷酸均为自制试剂;黄芩苷对照品(来源:中国食品药品检定研究院,批号:110715-201821,含量:95.4%);黄芩原药材(来源:南通三越中药饮片有限公司,批号:220208);牡丹皮原药材(来源:南通三越中药饮片有限公司,批号:220122)。

2 方法

2.1 正交实验设计

任洛漪[6]认为正交实验具有均匀性、合理性等优势,在某一确定的正交表中,某一因素的不同水平出现的次数相同,利用正交实验可以充分节约时间、提高效率等。故在本研究中采用正交实验方法。

通过查阅文献,笔者设置了时间(A)、温度(B)以及投药量(C)三个因素[7-8],确定炒制容器为铁锅、电磁炉。通过查阅文献中牡丹皮炭与黄芩炭的相关生产参数,对牡丹皮炭与黄芩炭的炮制参数进行初步设定。本研究设置预实验两组,牡丹皮炭投药量均为150g,温度以电磁炉功率表示为1 600W,炒制时间分别为250s与264s;黄芩炭投药量均为150g,温度为1 600W,炒制时间分别为230s与250s。在此条件下浸出物含量的检查均合格。以此为依据确定实验梯度,对牡丹皮炭设计L25(53)正交实验(见表1);黄芩炭设计L9(33)正交实验(见表2)。

表1 牡丹皮炭炮制因素与水平

表2 黄芩炭炮制因素与水平

2.2 浸出物测定

将牡丹皮炭与黄芩炭的粉末过2号筛,取供试品2～4g,精密称定,置250mL的锥形瓶中;用移液管精密移取乙醇100mL,用电子天平进行称重,静置1h;然后再加热回流1h,后置于冷水中使其冷却,再用电子天平进行称重,补足损失的质量;用漏斗(中速的定性滤纸)进行过滤操作,精密移取25mL续滤液置于干燥至恒重的蒸发皿中,置于水浴上蒸干;蒸干后置105℃烘箱干燥3h,迅速取出,置干燥器中冷却30min,并精密称定其质量。

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件 黄芩炭的含量测定(黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素),流动相A:0.1%磷酸;流动相B:甲醇;流动相C:乙腈;流动相D:水;进行梯度洗脱(见表3);流速1mL/min;柱温:30℃;检测波长为276nm[9]。

表3 黄芩炭梯度洗脱

2.3.2 对照品制备 取黄芩苷对照品的适量(对照品提前在60℃进行减压干燥4h),用分析天平进行精密称定,然后再加入70%乙醇,制成浓度为1mL/0.1mg的溶液,即得[9]。

2.3.3 供试品制备 将由正交实验获得的药材,按照四分法取样,打粉,过四号筛,精密称取供试品约0.1g,加入70%乙醇50mL,用电子天平进行称重,然后进行超声(功率250W,频率40kHz)15min,置于冷水中进行冷却,再用电子天平进行称重,补足减失的质量,取续滤液,即得。

2.4 外观性状

根据《江苏省中药饮片炮制规范》炭药的外观性状要求:黄芩炭表面黑褐色或焦黑色,牡丹皮炭外表面黑褐色,内部棕黄色;通过对比市场上黄芩炭与牡丹皮炭的外观性状,并通过比对文献[10]的评分标准,设计出本研究评分标准(见表4)。

表4 外观性状标准

3 结果

3.1 牡丹皮炭实验结果

结合中药炭药生产实际遇到的难题:浸出物含量不合格。故本实验将浸出物含量作为黄芩炭与牡丹皮炭的评价指标。综合评分的权重系数,考虑性状与浸出物同等重要,故赋予相同的权重系数。生产上,现有的黄芩炭与牡丹皮炭所含成分含量均为合格,在临床疗效中,黄芩苷作为主要成分,故黄芩苷权重系数为10%,黄芩素与汉黄芩素均为5%。(注:牡丹皮炭在《江苏省中药饮片炮制规范》无含量测定的检查,故本研究中不进行含量测定的检查。)

对牡丹皮炭,选取浸出物与性状作为综合评价指标[11]。综合评分=浸出物含量×50%+性状×50%,见表5,方差分析见表6。

表5 牡丹皮炭正交实验与综合评分指标

表6 方差分析

由表5、表6可知,R:A>C>B,即影响因素顺序为A>C>B,对于牡丹皮炭,时间的影响最大,投药量次之,温度影响最小。最佳组合为A1B1C5。

3.2 黄芩炭实验结果

对黄芩炭,考虑浸出物含量、黄芩素、汉黄芩素、黄芩苷,以及性状为综合评价指标,综合评分=浸出物含量×30%+黄芩素×10%+汉黄芩素×5%+汉黄芩素×5%+性状×50%,见表7,方差分析见表8。RSD均在0～2%之间。

表7 黄芩炭正交实验与综合评分指标

表8 方差分析

经过表7、表8的分析,R:C>A>B,即影响因素的顺序为C>A>B,对于黄芩炭,影响因素最大的是投药量,时间次之,最后是温度。最佳组合为A1B1C3。

3.3 验证实验

由实验结果所得到的最优组合,根据最优组合进行炮制,牡丹皮炭A1B1C5,黄芩炭A1B1C3,每种药在同等条件下炮制3组进行平行,结果显示,黄芩炭与牡丹皮炭的平均浸出物含量合格,且明显升高,但两者的性状均不符合《江苏省中药饮片炮制规范》规定;故选择较最优解最接近的k值,作为另一组合进行调整,并进行牡丹皮炭与黄芩炭炮制。即牡丹皮炭A2B2C4,黄芩炭为A3B2C2的组合。

经实验结果验证,牡丹皮的平均浸出物含量为16.16%,性状为表面黑褐色,内部棕黄色,浸出物含量与性状均符合《江苏省中药饮片炮制规范》的标准规定。黄芩炭的平均浸出物含量为28.60%,性状为黑色,内部褐色,浸出物含量不符合规定;又调整工艺组合为A1B2C2,经炭制之后,性状符合规定,炭制程度较前者较浅,浸出物的平均含量为38.62%,符合《江苏省中药饮片炮制规范》黄芩炭项下对浸出物及性状的规定。故牡丹皮炭的最佳组合确定为A2B2C4;黄芩炭的最佳组合确定为A1B2C2。

由以上实验结果验证得到最优炮制工艺,牡丹皮和黄芩炮制前后如图1、图2、图3、图4所示。

图1 生黄芩

图2 黄芩炭

图3 生牡丹皮

图4 牡丹皮炭

4 讨论

中药炒炭讲究“炒炭存性”,强调中药在炮制后外观性状既要符合标准规定,也要保存其原有的性味。牡丹皮在制炭过程中,能明显闻到牡丹皮的味道;并且随着炮制程度的不同,牡丹皮的香味浓度也不同;部分完全炭化或部分灰化的中药,牡丹皮原有的气味不复存在,其饮片质量也随之受到很大程度的影响。据现有文献查阅发现,牡丹皮经过碳制后,其浸出物含量明显降低,甚至急剧下降,这一结果可能与丹皮酚的挥发、分解等因素有关,这一点值得进一步探究。

黄芩在制炭时,利用正交实验,设置三因素三水平,以时间、温度、投药量为变量,以浸出物含量、黄芩苷含量、黄芩素含量、汉黄芩素含量与性状作为综合评价指标。从图5能够很明显看出黄芩苷、黄芩素与汉黄芩素峰面积的变化。其中,有几组几乎看不到峰,究其原因是黄芩在炒炭后,发生完全炭化,故其中黄芩苷、黄芩素与汉黄芩素成分的含量大为受损;炒炭后其浸出物的含量为10.10%,显著降低。由此可看出,中药在制炭过程中“炒炭存性”十分重要,炮制的程度与其所含的化学成分含量息息相关。

注:第二个峰为黄芩苷,第三个峰为黄芩素,第四个峰为汉黄芩素;从下往上,依次为正交实验的序号,每个样品做两组进行平行。图5 黄芩炭高效液相色谱

《中华人民共和国药典》2020年版[12]中,仅对大蓟炭、荆芥炭、荆芥穗炭与绵马贯众炭的浸出物含量作出了相关规定。《江苏省中药饮片炮制规范》2020年版之前的版本中,未曾对浸出物含量做相应要求。本研究从市场上选取10批黄芩与牡丹皮的原药材,黄芩原药材浸出物含量的平均值为58.0%(标准规定不少于40%);牡丹皮原药材浸出物含量的平均值为26.3%(标准规定不少于15%)。黄芩经过炭制之后,基本能达到《江苏省中药饮片炮制规范》中的相关要求;牡丹皮经过炭制之后,兼顾性状的同时,浸出物含量则无法达到要求。

中药炭药的炮制方法有清炒法、砂烫法和焖煅法[13],本研究使用的是清炒法。在牡丹皮炭与黄芩炭的炮制过程中发现,中药炭药浸出物含量的检查与含量测定的结果主要与炭药的性状密切相关。炭药又有轻炭、中炭、重炭之分:同一火力,炮制的药物程度不同,即表面黑褐色,内部棕黄色;或是表面焦黑色、内部焦褐色,前者为中炭,后者为重炭。对两者进行浸出物检查与含量测定检查,前者均较后者高,这一点对于牡丹皮炭与黄芩炭均适用。牡丹皮炭的最佳组合为A2B2C4,炒制结果为轻炭,只有此种炮制结果浸出物含量才符合要求;黄芩炭最佳组合为A1B2C2,为中炭,符合标准中的相关规定。

牡丹皮与黄芩经过炮制后,两者浸出物含量与有效成分含量均有所降低,水分也发生了明显下降。对炮制不同程度的饮片,进行浸出物含量检查,实验过程中,在过滤时,炭化程度深的样品,其过滤速度相对较慢,其原因与炭的吸附力有关。对于炭药而言,可以通过回流过滤后,根据滤液的颜色初步判断出浸出物含量的多少,颜色较浅则可推测出其浸出物的含量较少。

牡丹皮中含有丹皮酚,丹皮酚熔点较低,炒制温度过高时易挥发。黄芩含有黄芩苷,易转化为黄芩素。沈安等[14]研究发现,黄芩苷在加热的条件下化学结构极易转化,因而引发出一个问题:浸出物含量的降低与此类成分的降低是否有关,值得进一步深入探索。

中药制炭,自古以来讲究“炒炭存性”的重要性,轻炭与中炭的制法可以使饮片达到相关要求,且其原有的性味仍然存在,而饮片在经过重炭的制法后则只有炭味,而未保留中药原有的性状。由此可见“炒炭存性”在中药炮制中有着举足轻重的地位。目前,炭类中药的浸出物含量、成分含量与不同程度炭类中药之间的关系尚不完全明确,这是应当探索的问题,对更好解决大工艺生产中的相关问题具有重要意义。