杨海玲,苏国惠,黄华枫,颜彩莲,陆东萍,刘振杰

(广西中医药大学,广西 南宁 530001)

桑叶为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥叶,具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目功效,常用于风热感冒、肺热燥咳、目赤昏花、头晕头痛等[1],在《本草纲目》中又有“神仙叶”之称[2]。桑叶炮制历史悠久,有蜜炙[3]、蜜水拌蒸[4]、微炒[5]、蒸熟[2]、九蒸九晒[6]、烧存性[7]等多种炮制方法。生桑叶与蜜桑叶的炮制方法一直沿用至今,生桑叶在《中华人民共和国药典》2020年版与各省市炮制规范中均有收载,蜜桑叶则多收载于全国及各地方的炮制规范中[8-11],但其蜜炙方法与工艺并不一致,缺乏了统一标准。现代研究表明,桑叶中含有黄酮、生物碱、多糖等多种化学成分,其中绿原酸、芦丁、紫云英苷、异槲皮苷和槲皮素等具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗肿瘤和保护心血管等药理活性[12-15];但目前有关其炮制工艺与活性成分影响的报道较少[16-17]。在对照品缺乏的情况下,采用一测多评法(QAMS)在中药饮片及中成药进行质量控制方面已有一定应用[18-20]。因此本实验采用高效液相色谱法(HPLC),以芦丁为参照物,运用一测多评法建立绿原酸、异槲皮苷、紫云英苷和槲皮素的相对校正因子,并对桑叶、蜜炙桑叶、蜜烘桑叶、清炒桑叶、蜜水拌蒸桑叶工艺进行研究,分析比较炮制前后上述5种化学成分含量的变化,以期为桑叶炮制工艺、炮制原理及临床合理用药提供实验依据。

1 仪器与试剂

1.1 实验材料

桑叶购自南宁市宾阳县万润本草有限公司中药饮片厂(批号:17082101),经广西中医药大学梁子宁教授鉴定为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥叶。

对照品:紫云英苷(批号:MUST-18031820),异槲皮苷(批号:MUST-17051005),购自中国科学院成都生物研究所;绿原酸对照品(批号:PS08072303),芦丁(批号:PS03180500);槲皮素对照品(批号:PS06050025),购自成都普思生物科技股份有限公司。甲醇、乙腈均为色谱纯(Fisher);娃哈哈纯净水,其他试剂均为分析纯。蜂蜜(上海冠生园蜂制品有限公司,批号182404Y2)。

1.2 实验仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);SQP电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司);KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 炼蜜

取蜂蜜适量置于不锈钢锅,加20%左右的温水,文火(400W)进行加热至浅黄色(116～118℃),用手捻之有黏性且无长白丝出现,即得。

2.2 桑叶不同炮制品的制备

2.2.1 桑叶 取原药材,除去杂质,搓碎,去柄,筛去灰屑,即得。作为样品1,见表1。

表1 桑叶炮制品的制备

2.2.2 清炒桑叶 取桑叶100g,置预热电炒锅内,用文火(400W)炒,至颜色略变黄、变脆,取出,即得。作为样品2,见表1。

2.2.3 蜜蒸桑叶 取桑叶100g,加入定量冷开水稀释的炼蜜,拌匀闷润1h,蒸1h,于55℃烘箱中干燥 4h,取出放凉,即得。作为样品3,见表1。

2.2.4 蜜炙桑叶 取桑叶100g,加入定量冷开水稀释的炼蜜,拌匀闷润1h,置预热电炒锅内,用文火(400W)炒至颜色加深、不粘手时,取出放凉,即得。作为样品4～8,见表1。

2.2.5 蜜烘桑叶 取桑叶100g,加入定量冷开水稀释的炼蜜,搅匀闷润1h,于烘箱中55℃干燥4h,取出放凉,即得。作为样品9～13,见表1。

2.3 色谱条件

色谱柱:KROMASIL 100-5 C18(250mm×4.6mm),流动相:乙腈(A)-0.2%磷酸水(B),梯度洗脱条件:0～9min,15%～20%A;9.01～20min,20%～25%A;20～30min,25%～35%A;30～37min,35%～38.5%A,流速:0.6mL/min;波长:360nm;柱温:30℃;进样量:20μL。该色谱条件下,桑叶各炮制品5个色谱峰分离效果良好。结果见图1。

注:A.桑叶;B.炒桑叶;C.蜜蒸桑叶;D.蜜炙桑叶;E.蜜烘桑叶;F.混合对照品。1.绿原酸;2.芦丁;3.异槲皮苷;4.紫云英苷;5.槲皮素。图1 不同炮制工艺桑叶饮片及混合对照品HPLC

2.4 对照品溶液的配制

精密称取紫云英苷12.75mg、绿原酸50.00mg、芦丁68.75mg、异槲皮苷12.50mg、槲皮素0.98mg置于同一50mL棕色容量瓶中,加50%甲醇溶解并定容至刻度。精密量取上述对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL至量瓶中,用50%甲醇定容至10mL,即得。

2.5 供试品溶液的制备

取样品粉末(40目)约1.0g,精密称定,置100mL磨口锥形瓶中,用25mL移液管加入50%甲醇,在90℃的温度下加热回流30min,取出放冷后过滤,滤渣再用50%甲醇25mL以相同的方法提取2次,最后合并3次回流提取的滤液,用旋转蒸发仪浓缩滤液后将滤液转移至50mL容量瓶中,加50%甲醇定容至刻度,离心即得。

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察 精密吸取绿原酸、芦丁、紫云英苷、异槲皮苷、槲皮素的不同浓度混合对照品溶液,按“2.3”项下色谱条件进行进样与测定,以对照品的进样量(μg)为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,结果见表2。结果显示,各成分在各自浓度的范围内呈良好的线性关系。

表2 桑叶中5种成分的线性关系考察结果

2.6.2 精密度试验 精密吸取“2.4”对照品溶液10μL,按“2.3”项下色谱条件连续进样6次,计算各峰峰面积RSD,结果绿原酸、芦丁、紫云英苷、异槲皮苷、槲皮素分别为1.08%、2.03%、1.68%、2.13%、1.64%,表明试验仪器精密度良好。

2.6.3 重复性试验 取桑叶粉末(40目),按“2.5”项下方法平行制备6份样品溶液。在“2.3”色谱条件下进行检测,测定绿原酸、芦丁、紫云英苷、异槲皮苷、槲皮素的峰面积。结果绿原酸、芦丁、紫云英苷、异槲皮苷、槲皮素含量依次为1.44、0.67、0.12、0.46、0.04mg/g,RSD分别为1.79%、1.17%、1.76%、1.69%、2.43%。证明本研究所建立的方法重复性良好。

2.6.4 稳定性试验 精密吸取桑叶供试品溶液20μL,按“2.3”项下色谱条件,分别在0、2、4、6、8、12h进样,测定峰面积,计算绿原酸、芦丁、紫云英苷、异槲皮苷、槲皮素峰面积RSD值分别为1.45%、1.40%、1.77%、2.01%、2.64%,表明供试品溶液12h内稳定。

2.6.5 加样回收率试验 称量已知含量的桑叶粉末(40目)6份,每份约0.5g,精密称定。分别精密加入适量绿原酸、芦丁、紫云英苷、异槲皮苷、槲皮素对照品溶液。按“2.5”项下的方法制备供试品溶液,按“2.3”项下色谱条件进行测定,计算加样回收率和RSD值。结果绿原酸、芦丁、紫云英苷、异槲皮苷、槲皮素平均加样回收率分别为 100.06%、100.09%、98.48%、102.02%、99.05%,RSD依次为1.43%、1.98%、2.08%、1.32%、2.15%,表明该方法准确度良好。

2.7 校正因子重现性考察

2.7.1 高效液相色谱仪及色谱柱考察 试验考察采用Agilent 1260、Waters e2690、ShimadzuLC-20A 3种高效液相色谱系统和SHIMADZU VP-ODS C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)、KROMASIL 100-5 C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)、Diamonsil C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm) 3种色谱柱时的相对校正因子;相对校正因子=Ai×Cs/As×Ci,式中As为待测成分s的峰面积,Cs为质量浓度;Ai为内参物i的峰面积,Ci为质量浓度。分别计算绿原酸(A)、异槲皮苷(B)、紫云英苷(C)和槲皮素(D)与内参物芦丁(S)的相对校正因子,结果见表3。结果表明,在不同的色谱柱及高效液相色谱仪下中具有较好的重现性,能够用于上述5种成分的含量测定。

表3 不同仪器和不同色谱柱测得相对校正因子

2.7.2 待测组分色谱峰的定位 本研究采用各待测成分间的相对保留值(待测成分与内参物调整保留时间之比)作为定位标准,并在不同品牌高效液相色谱系统和不同色谱柱下对该参数进行考察,结果表明,不同仪器和色谱柱下各成分间的相对保留值波动较小,RSD在0.19%～0.71%,见表4。此结果说明,在对照品短缺的情况下,利用相对保留值进行色谱峰定位,可根据内参物的保留时间,通过结合各色谱峰的紫外吸收特征及相对保留值能够较准确目标峰的峰位置。因此选用各成分相对保留值这一参数作为桑叶中上述5种目标色谱峰的定位指标比较合理。

表4 不同仪器和不同色谱柱下目标成分的相对保留值

2.8 外标法与QAMS法测定的结果比较

分别称取广西桑叶不同炮制品粉末(40目)约1.0g,精密称定,按“2.5”项下制备供试品溶液,按照“2.3”项下测定,分别采用外标法(EMS)和QAMS法对不同炮制品中5种活性成分含量进行检测,结果见表5和图1。经t检验比较,结果显示外标法实测含量值与QAMS计算的含量值无显著性差异,由此说明一测多评法可用于桑叶饮片的多成分质量评价研究。

表5 外标法和QAMS测定广西桑叶饮片中5种成分的含量 (n=3,mg·g-1)

3 讨论

3.1 供试品溶液提取方法考察

试验前期曾以桑叶粉末(40目)比较桑叶供试品溶液提取方法,结果显示索氏回流提取法[21]中5种成分峰面积最小,效果最差;75%乙醇超声提取两次,提取液合并后用石油醚(60～90℃)萃取的方法[22]与25mL甲醇回流提取3次的方法[23]提取效果相当,含量均高于甲醇超声提取两次的方法[24],文献方法[22]增加石油醚溶剂萃取的程序,不但增加了时间成本,而且耗费时间长,工艺繁琐,因此从提取所需的时间、溶剂的成本、提取方法的简便程度等方面考虑,最终本实验选择用25mL甲醇回流提取3次。在确定加热回流提取方式后,笔者进一步对不同提取溶剂(50%、75%、100%甲醇)、提取温度(65℃、70℃、80℃和90℃)、提取次数(1、2、3次)、溶剂用量(15、25、35mL)进行考察,最终确定本研究供试品溶液的制备方法。

3.2 桑叶5种活性成分含量研究

本研究首次采用高效液相色谱法,以芦丁为参照物,建立绿原酸(A)、异槲皮苷(B)、紫云英苷(C)和槲皮素(D)的相对校正因子,将桑叶及其蜜制品建立的一测多评方法用于桑叶饮片多指标质量评价。用一测多评法和外标法测定上述5种活性成分含量,结果表明桑叶经炮制后绿原酸、芦丁、紫云英苷和异槲皮苷的含量增加,且在用蜜量相同情况下,呈现出相同的变化趋势,均为蜜烘桑叶>蜜炙桑叶>蜜蒸桑叶>炒桑叶>桑叶;槲皮素含量则降低,桑叶>炒桑叶>蜜烘桑叶>蜜炙桑叶>蜜蒸桑叶。其中绿原酸含量与国内学者报道[15]的桑叶经蜜炙后含量降低结果不一致,芦丁、异槲皮苷含量与文献[16]“炒桑叶>蜜桑叶>桑叶”的结果亦不尽相同,这可能是炒桑叶、蜜蒸桑叶、蜜桑叶、蜜烘桑叶均是经加热蒸制、炒制或烘制而成,加热破坏了药物自身所含分解酶,起到杀酶保苷的作用,或者是由于经过加热处理后药物中所含成分在相同条件下被提取更加完全;蜜烘桑叶的含量最高,一方面可能是由于炼蜜对桑叶中绿原酸、芦丁等黄酮苷类成分起到一定保护作用,同时烘制温度相对稳定、均一,在一定程度上较好地保存药物中有效成分。绿原酸和芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量在各炮制品中以15%蜜烘桑叶的最高,分别是桑叶的1.96、1.76、2.52和2.79倍;进一步分析发现,在同一方法(蜜炙法或蜜烘法)下,样品中芦丁、绿原酸、紫云英苷和异槲皮苷的含量,随着用蜜量的增加则出现了降低的现象,对槲皮素含量影响变化不明显,这提示适量的蜂蜜可能有增加药物溶出的作用,但用蜜量增加到一定程度后反而可能会影响药物的成分溶出。这结果也再次印证了“贵在适中”的传统炮制理论。

蜜制桑叶的炮制方法虽在全国中药炮制规范及各省市地方炮制规范中均有收载,但其加蜜量、炮制火候程度却不尽相同,这必将影响其临床疗效,因此十分有必要进一步对桑叶蜜制工艺进行深入研究。且大多数地方炮制规范均未建立桑叶饮片指标成分含量测定标准,不利于饮片质量控制。本研究在工艺规范的前提下,建立一测多评法同时测定桑叶中绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素等5种有效成分含量测定方法,建立其限量要求,对于桑叶饮片的质量控制具有一定意义,因此建议在省市炮制规范中予以明确同时增加相应指标成分含量限度。

4 结论

本研究运用校正因子法从量上反映广西桑叶不同炮制品之间主要有效成分(有机酸、黄酮)间的相互关系,该研究方法具有方法简单、快速、准确,可用于桑叶多指标成分含量测定,可为更好地控制桑叶饮片的质量提供条件。加热和蜜制均对广西产桑叶化学成分产生了一定影响。