司原成,任晨晨,陈 波,张二伟,康朝霞,李志菊,高璐琪

(贵州中医药大学,贵州 贵阳 550025)

肥胖的问题日趋严重,已成为全球流行的慢性疾病[1-2],其形成发展与脂质代谢关系密切[2]。研究表明,单纯性肥胖症患者存在一定程度血脂异常,血清中脂肪细胞分泌的脂肪细胞因子显著高于正常人[3]。中医名家朱丹溪《丹溪心法》阐明“肥人多痰湿”[4],《黄帝内经》详载过食肥甘、膏粱厚味等物,易于阻碍脾胃运化功能,导致肥胖出现[5]。针灸是中医学中重要的治疗方法之一,电针是针刺方法之一[6]。针灸治疗单纯性肥胖从健脾、益气、化痰等角度入手,治疗单纯性肥胖症,选择中脘、关元、天枢、足三里等四穴疏通经络、通调腑气,降脂化痰,调控脂质代谢途径[7]。

课题组在肥胖研究过程中,利用新科学技术探寻肥胖治疗的有效方式,在电针治疗肥胖显效的基础上,比较治疗前后脂肪酸合成酶(Fas)代谢调控的显著变化,深入研究揭示单纯性肥胖症的机制。现将课题组研究成果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 50只SPF级C57BL/6小鼠,8周龄,体质量(30±2)g,购买于长沙天勤生物技术有限公司[许可证号:SCXK(湘)2019-0013],饲养于贵州中医药大学针灸推拿学院实验动物房内,温度23～25℃,湿度40%～60%,昼夜各半,7∶00-19∶00开灯,19∶00-7∶00关灯。自由摄食饮水。实验符合贵州中医药大学动物伦理委员会实验动物福利和伦理相关规定,伦理编号:20210022。

1.1.2 实验试剂 武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司的脂联素(ADPN)试剂盒(批号:57KIPS 7RAG)和瘦素(LEP)试剂盒(批号:Q263T2L4IP);南京建成生物工程研究所的CHO试剂盒(批号:20210629)和TG试剂盒(批号:20210629)。

1.1.3 实验仪器 全自动酶标仪(型号:ELX808 IU-P;厂家:美国宝特公司);小型高速台式冷冻离心机(型号:Multiskan X1R;厂家:美国THermoScientic公司);快速核酸提取仪(型号:FastPrep-24;美国MP Biomedicals公司);电子针灸治疗仪(型号:G6805-Ⅱ型;青岛鑫生实业有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 课题实验参照高脂饮食诱导肥胖,建立C57BL/6小鼠肥胖症模型[8-9]。将购买得到的50只小鼠,适应性喂养5d,随机选取10只作为正常组,其余40只饲以高脂饮食8周,得到体质量显著高于正常组均值20%的肥胖小鼠20只。正常组小鼠,继续喂养普通饲料,肥胖鼠继续饲养高脂饮食。

1.2.2 分组及干预 将复制得到的20只肥胖小鼠均分成模型组和电针组。电针组,所选穴位参照2021版《实验针灸学》[10],斜刺天枢4mm,斜刺关元5mm,直刺足三里3mm,直刺三阴交4mm,施以捻转手法,得气后,接通电针仪,疏密波,30～150Hz之间,强度1～2mA,以局部轻微颤抖为度,留针10min,日1次,左右交替取穴,正常组与模型组不予电针干预,以相同方式固定10min。

1.2.3 取材 每周定期测量所有小鼠体质量、体长等指标。实验治疗干预后,股动脉采血,脱颈椎处死,无菌操作剖开腹腔,剪取肾周脂肪组织和肝脏组织,称重后,剪取1cm×1cm大小的组织,放置于无菌无酶的2mL平底EP管中,-80℃冰箱保存,用于检测Fas代谢相关指标的差异变化。

1.2.4 检测 (1)酶联免疫吸附测定(ELISA):参照ELISA试剂盒操作说明书,测定实验鼠血清血脂CHO、TG、LEP、ADPN及脂肪组织中Fas含量的差异变化。

(2)HE染色:参照HE染色的说明书和操作方法,观察选择400倍视野下上、下、左、右四个脂肪细胞的直径进行分析,观察各组脂肪组织直径的差异变化。

(3)油松染色:使用200倍成像的显微镜,使用Image-Pro Plus 6.0分析软件测量每张切片中三个视野脂滴像素面积和对应的组织像素面积,计算公示如下:脂滴面积占比(%)=脂滴像素面积/组织像素面积×100%。

(4)Fas基因及蛋白的相对表达量:检测Fas基因采用Rt-PCR方法进行[11]。利用Trizol法提取组织总RNA,通过提取试剂盒逆转录获得cDNA,再通过目标引物(5′-AGCCCGGCCAGCGATACAGA-3′;3′-TGGATACCGGGCCCACCAGG-5′)测定Fas基因的相对表达量。检测Fas蛋白采用Western blot(WB)方法进行。参照蛋白提取试剂盒说明书,提取小肠中段组织的总蛋白,通过Fas的单克隆抗体检测其在各组实验鼠中的含量水平。Rt-PCR和WB方法检测,重复3遍。

2 结果

2.1 电针对营养性肥胖鼠体质量及Lee’s指数的影响

如表1所示,治疗前,模型组和电针组实验鼠体质量及Lee’s指数均显著高于正常组;经电针干预21d后,电针组的实验鼠体质量及Lee’s指数均明显降低。

表1 电针对营养性肥胖鼠体质量及Lee’s指数的影响

2.2 电针对营养性肥胖鼠血脂及血糖的影响

如表2所示,模型组血清CHO、TG、LDL-C含量均明显高于正常组,经电针干预21d后,电针组实验鼠血清CHO、TG、LDL-C均明显降低。各组血清HDL-C和血糖均无明显变化。

表2 电针对营养性肥胖鼠血脂及血糖的影响

2.3 电针对营养性肥胖鼠脂肪细胞因子ADPN及LEP的影响

如表3所示,模型组肾周脂肪组织中ADPN明显低于正常组,而LEP含量均明显高于正常组;经电针干预21d后,电针组实验鼠肾周脂肪组织中ADPN明显升高,LEP含量均明显降低。

表3 电针对营养性肥胖鼠脂肪细胞因子ADPN及LEP的影响

2.4 电针对营养性肥胖鼠肾周脂肪细胞形态的影响

图1所示,模型组肾脏周围脂肪组织的质量(图1d)、细胞形态直径(图1 b)的均值显著高于正常组(图1a),电针治疗后肾脏周围脂肪的质量和细胞直径(图1c、图1e)明显减少。

图1 各组肾脏周围脂肪组织的形态、脂肪细胞直径的变化

2.5 电针对营养性肥胖鼠肝脏组织中脂肪细胞形态的影响

如图2所示,模型组肝脏组织中油粒大小的分布(图2b)的均值显著高于正常组(图2a),电针治疗后肝脏组织中油粒分布明显降低(图2c)。

图2 各组肝脏组织中油粒分布的差异变化

2.6 电针对营养性肥胖鼠各组脂肪组织中Fas含量、Fas基因及蛋白的相对表达的变化

如图3a所示,模型组脂肪组织中Fas的含量显著高于正常组,经电针干预治疗后,肥胖鼠脂肪组织中Fas的含量均显著下降(P<0.01)。如图3b所示,模型组脂肪组织中Fas基因的表达的显著高于正常组,经电针干预治疗后,肥胖鼠脂肪组织中Fas基因的表达显著下降(P<0.01)。如图3c所示,模型组脂肪组织中Fas蛋白的表达显著高于正常组,经电针干预治疗后,肥胖鼠脂肪组织中Fas基因的表达显著下降(P<0.01)。

图3 各组脂肪组织中Fas含量、Fas基因及蛋白的相对表达的变化

3 讨论

目前,单纯性肥胖症已成为健康问题,是健康的高危影响因素,其与众多疾病关系密切,如糖尿病、高血压、高脂血症、关节炎及部分癌症等[12]。单纯性肥胖症在形成发展进程中,与机体脂质代谢异常关系密切,常伴随有血脂异常升高,脂肪细胞分泌的细胞因子(ADPN、LEP等)明显升高,这些细胞因子是调整机体脂质代谢平衡的重要内分泌激素,其水平的高低直接关系机体脂质代谢调控[13]。此外,有研究表明[14],单纯性肥胖症的发展还与机体脂肪细胞的堆积有关,进一步造成肥胖症患者体型的异常发展[15]。

在传世的中医学经典著作中,单纯性肥胖症的形成病因与痰、湿、虚、瘀四大因素有关,体现为本虚(气虚)、标实(膏脂、痰浊)的证候。先天禀赋不足,嗜以膏粱厚味,脾失健运,导致痰湿蓄积而发肥胖[16]。通常运用健脾、益气、祛湿、化痰的方法进行治疗,整体调节脏腑功能,促进脂质代谢分解。针灸是中医学干预疾病的重要治疗手段之一,通过疏通经络、调理肠腑、祛湿化痰等作用治疗单纯性肥胖症[17]。电针是针刺疗法常用且可量化实施的方法之一,目前广泛应用于治疗针灸适宜病种,如单纯性肥胖症[18]。电针将电信号以波的形式输送到针刺部位,持续为针刺腧穴行针,提高针刺治疗效果,而且电针输送生物电信息,通过针体直接作用于脂肪层,促进脂肪组织的脂质代谢,更好达到减肥消脂的目的[19]。电针选取中脘、关元、天枢、足三里四穴进行治疗,中脘是“腑会”和“胃之募穴”,调理肠胃,促进代谢;天枢是“大肠募穴”,疏调水道,消脂减肥;关元是“小肠募穴”,调解肠腑功能;足三里是胃“下合穴”,治疗胃肠疾患;四穴合用,共奏健脾、益气、减肥、消脂功效[20]。

本实验选用近交系C57BL小鼠,其较容易建立稳定的营养型肥胖模型[21],通过60%的高脂饲料喂养,约有50%的小鼠能够肥胖。通过观察不同组别实验鼠的整体水平数据,课题组发现电针显著降低肥胖鼠体质量和体脂;进一步研究表明,模型肥胖鼠血清CHO和TG显著高于正常组,经过治疗后,显著降低肥胖鼠血清CHO和TG的含量。脂肪组织分泌特有激素脂肪细胞因子ADPN和LEP是调解脂质代谢的关键激素,合成及堆积脂肪,通过活化肌肉组织中腺苷酸激活蛋白激酶途径及过氧化物酶体增殖物激活受体α,增加脂肪酸氧化,抑制脂肪脂质代谢[22]。模型肥胖鼠肾脏周围脂肪组织中分泌的ADPN和LEP均显著高于正常鼠,经过治疗后,肥胖鼠的脂肪组织中的ADPN和LEP也得到有效改善。在单纯性肥胖的形态学研究中,模型肥胖鼠肾脏周围脂肪细胞的直径和体积显著增加,肝脏组织细胞中的脂肪油粒比重显著高于正常小鼠,经过治疗后,肥胖鼠肾脏周围脂肪细胞直径及肝脏组织细胞中脂肪油粒明显减小。

在脂质代谢中,Fas起关键作用,在脂肪组织储存和运输能量,维持细胞结构稳定,提供多种激素合成所需的中间产物等方面起到重要作用[23]。模型肥胖鼠肾周脂肪组织中Fas含量显著高于正常鼠,并肾周脂肪组织中的Fas基因和蛋白的表达显著高于正常鼠,经治疗后,肥胖鼠肾脏周围脂肪组织中Fas含量及基因蛋白的表达显著降低,表明电针具有调整Fas基因及蛋白表达的重要作用。

综上所述,电针良性调控对营养型肥胖症小鼠的体质量、血脂(CHO、TG)、脂肪细胞因子(ADPN、LEP)、脂肪组织的形态及油粒分布。在机体脂质代谢上,电针显著调节脂肪组织中的FAS含量及基因和蛋白的表达功能,进而调整机体脂质代谢。课题组会在进一步的研究中确认其更密切的作用关系。电针改善肥胖症的脂质代谢有重要意义。