张晓莹，王家军，朱春艳，刘张淮，张荧荧，张洮

（宝应县农业技术综合服务中心，江苏 宝应 225800）

中华草龟（Chinemys reevesii），又名乌龟、金龟、泥龟、长寿龟，有延年益寿、吉祥的寓意。属于爬行纲（Reptilia），龟鳖目（Testudine），龟科（Emydidae），是我国分布最广、数量最多的一种龟，因其具有生长速度快、抗病能力强和具有观赏性等特点，养殖前景十分广阔。但随着中华草龟养殖产业的不断发展，各类疾病也日益增多。目前已有研究从患病中华草龟，分离出维氏气单胞菌（Aeromonas Veronii）[1]、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）[2]、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）[3]、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）[4]、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）[5]等病原菌。产吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium indologenes）属于金黄杆菌属（Chryseobacterium），是一类革兰阴性菌，为条件致病菌，是一种高度耐药的细菌，目前已从患腐皮病的中华鳖溃烂处[6]、乌鳢肝肾等组织[7]分离出产吲哚金黄杆菌（C.indologenes），从鲫的脾脏分离出金黄杆菌（Chryseobacterium）[8]。伊丽莎白菌属（Elizabethkingia）是Kim 等[9]在2005 年提出的新菌属，归属于黄杆菌科（Flavobacteriaceae），为条件致病菌，广泛存在于水、土壤等自然环境中；伊丽莎白菌属包括米尔伊丽莎白菌（E. miricola）、按蚊伊丽莎白菌（E. anophelis）、脑膜败血伊丽莎白菌（E. meningoseptica）等，可引起人类脑膜炎、败血症和肺炎等疾病[9]。该菌属已从乌鳢[10]、中华鲟[11]、中华鳖[12]以及蛙类[13-16]体分离出来，感染该菌后，导致动物的肝脏、脾脏和肾脏组织损害严重[10-12]。伊丽莎白菌属（Elizabethkingia）引起的人类细菌感染，在世界范围内呈现上升趋势，尤其是按蚊伊丽莎白菌（E.anophelis）引起的感染[17]，目前已疑似在患病乌鳢身上分离出该菌[10]。按蚊伊丽莎白菌（E. anophelis）是一类革兰阴性菌，在我国主要分布在秦岭-淮河线以南湿润地区，而湿润的亚热带气候区的北移，可能会导致该菌在我国分布范围更广[18]。现对患病的中华草龟进行细菌分离、鉴定及药敏试验，以期为中华草龟细菌性疾病的防治和针对性治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

患病中华草龟摄食量较少，眼球明显突出，眼部有脓血水渗出。

1.1.2 试剂

营养琼脂培养基购自南通凯恒生物科技发展有限公司；DNA 提取试剂盒、Premix Taq Version 2.0均购自TaKaRa 公司；ddH2O 及引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司；测序服务由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；细菌鉴定板购自碧迪医疗器械（上海）有限公司；动物用药敏检测分析试剂盒购自南京菲恩医疗科技有限公司。

1.1.3 仪器

BSC-1300A2 生物安全柜（苏州智净净化设备有限公司）、SHP-160 型生化培养箱（扬州市三发电子有限公司）、THZ-82B 型空气摇床（上海梅香仪器有限公司）、BG25 干式恒温器（杭州朗基科学仪器有限公司）、MIKRO 200R 台式高速冷冻离心机（德国Hettich 科学仪器有限公司）、BD PhoenixSpecTM比浊仪（Becton Dickinson & Company）、CFX96 Real-Time PCR 仪（Bio-Rad）、BG-Power 600 型电泳仪（BayGene）、Tanon 3500B 凝胶成像系统（上海天能生命科学有限公司）及BD 半自动细菌鉴定仪（Becton Dickinson & Company）。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与培养

在无菌条件下，使用无菌接种环，蘸取中华草龟眼部病灶部位，于营养琼脂培养基上划线，共接种3 个平板，置于28 ℃恒温培养箱中培养24 h，挑选形态大小一致的优势菌落，进一步纯化培养并进行革兰染色，共挑取2株优势菌，分别命名为2022-11-11-WG-1 和2022-11-11-WG-2。

1.2.2 生理生化试验鉴定

使用比浊仪，配制比浊度为0.5 mcf 的菌液，倒入鉴定板中，将鉴定板放入35～37 ℃生化培养箱中孵育18～24 h，将孵育完成的鉴定板取出，使用BD半自动细菌鉴定系统判读鉴定结果。

1.2.3 16S rDNA 基因序列测定及分析

将生理生化鉴定方法与分子生物学鉴定方法相结合[19]。将分离菌震荡培养24 h 后，参考DNA 提取试剂盒操作说明，提取纯化菌株的DNA，将其作为模板进行PCR 扩增。PCR 反应体系（25 μL）：Premix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，正反向引物各1 μL，模板1 μL。PCR 反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s；56 ℃退火15 s；72 ℃延伸10 s，35 个循环；72 ℃延伸10 min。一部分扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。16S rDNA 序列扩增使用通用引物，F：5'-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3'和R：5'-GACGGGCGGTGTGTACAA-3'，参考文献[20]的方法。剩下的PCR 扩增产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司，进行16S rDNA 基因测序。将分离株16S rDNA 测序结果在NCBI 中进行blast 比对。

1.2.4 药敏特性分析

使用动物用药敏分析试剂板检测8种常见水产抗生素的药物敏感性。挑取纯化后的单个菌落于5 mL 生理盐水中，制成0.5 mcf 浓度的菌悬液制成A 管，取2 支10 mL 的无菌生理盐水，打开任意一瓶，以无菌的方式向阴性对照孔中分别加入200 μL无菌生理盐水，从A 管中吸取200 μL 菌悬液，加入10 mL 无菌生理盐水，倒入V 型槽中。混匀后，利用微量移液器吸取V 型槽中的菌液，加入所有微孔中（阴性对照除外），每孔200 μL，将加样好的药敏分析试剂板，放入28 ℃的恒温培养箱中，培养24～28 h 后读取结果。

判断标准：与阳性对照孔比较，药敏分析试剂板孔底变浑浊，为阳性（+）；药敏分析试剂板孔底澄明，为阴性（-）。以在微孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度（MIC）。

2 结果与分析

2.1 细菌分离及菌落形态

从患病中华草龟眼部分离出两株优势菌，见图1（a）（b）。由图1 可见，菌株在营养琼脂培养基上生长良好，2 株均为革兰阴性菌。分离菌株培养24 h后，2022-11-11-WG-1 菌落形态特征为：黄色，凸起，表面光滑，边缘整齐；2022-11-11-WG-2 菌落形态特征为：米色，表面光滑，边缘整齐。

图1 2株优势菌

2.2 细菌生物系统初步鉴定

将2 株菌株接种到生化反应板上，对2种菌株进行30 项生理生化试验，结果见表1。由表1 可见，初步鉴定2022-11-11-WG-1 为产吲哚金黄杆菌（C. indologenes），2022-11-11-WG-2 为按蚊伊丽莎白菌（E. anophelis）。

表1 细菌生物系统初步鉴定结果①

2.3 16S rDNA 鉴定

将测序获得的基因序列在NCBI 中进行blast比对，结果表明，2022-11-11-WG-1 与金黄杆菌属（Chryseobacteriumsp.）相似性为99%（登录号：MH801979）；2022-11-11-WG-2 与按蚊伊丽莎白菌（E. anophelis）（登录号：OQ210041）和米尔伊丽莎白菌（E. miricola）（登录号：CP115634）的序列相似性均为99%。

综合菌落形态特征、生理生化特性测定及分子生物学鉴定方法，初步判定病原菌2022-11-11-WG-1 为产吲哚金黄杆菌（C. indologenes），2022-11-11-WG-2 为按蚊伊丽莎白菌（E. anophelis）。

2.4 药敏试验

根据美国临床和实验室标准化协会《抗微生物敏感试验的执行标准（CLSI）（2019 版）》，判断菌株对8种抗生素敏感程度。2种分离菌株对8种常见水产抗生素敏感程度见表2。2022-11-11-WG-1 产吲哚金黄杆菌（C. indologenes）和2022-11-11-WG-2 按蚊伊丽莎白菌（E. anophelis）均对恩诺沙星、甲砜霉素、氟苯尼考及盐酸多西环素敏感，对硫酸新霉素、氟甲喹、磺胺间甲氧嘧啶钠及磺胺甲恶唑+甲氧苄啶具有较强的耐药性。

表2 菌株药敏特性①mg/L

3 讨论

本试验从患病中华草龟眼部分离出产吲哚金黄杆菌（C.indologenes）和按蚊伊丽莎白菌（E.anophelis）2种菌株。产吲哚金黄杆菌（C. indologenes）可引起人类肺炎、败血症、脓毒血症等疾病，是人和动物共患病原菌。产吲哚金黄杆菌（C. indologenes）耐药范围较广，杨移斌等[6]建议养殖过程中如发现中华鳖感染产吲哚金黄杆菌（C. indologenes），可选用庆大霉素、新霉素或者阿莫西林内服，并配合使用二氧化氯、漂白粉及高铁酸钾等外用进行防控；王鑫毅等[7]建议使用米诺环素、利福平、头孢西丁、多西环素、恩诺沙星、依诺沙星、诺氟沙星等7种抗生素对乌鳢产吲哚金黄杆菌（C. indologenes）进行治疗。本试验从患病中华草龟眼部分离的产吲哚金黄杆菌（C. indologenes）对恩诺沙星、甲砜霉素、氟苯尼考及盐酸多西环素敏感。

伊丽莎白菌属（Elizabethkingia）能感染动物和人类，其致病机制包括侵入宿主细胞、裂解血小板和产弹性蛋白酶等，该菌属具有多重耐药性[21]。刘晓琳等[10]从患病乌鳢身上分离出疑似按蚊伊丽莎白菌（E. anophelis），并进行了人工回归感染试验，证实该菌对乌鳢有较强致病性，建议将米诺环素、利福平、多西环素、磺胺异恶唑作为治疗候选药物。蔡完其等[12]从发病中华鳖肝脏分离出脑膜败血伊丽莎白菌（E. meningoseptica）（曾被称为脑膜炎败血性黄杆菌），根据药敏试验结果，配制了鳖必康Ⅲ号对其治疗。李旭东等[16]从具有歪头、破头与白眼等症状的蛙体，分离出米尔伊丽莎白菌（E. miricola），该菌对青霉素、阿莫西林等19种抗生素表现出不同程度的耐药，仅对氟苯尼考高度敏感。本试验中的中华草龟，之所以会感染病原菌，可能与养殖过程中存在相互撕咬、投喂的饲料中存在病原菌、或者是养殖水体中有病原菌等有关。建议使用恩诺沙星、甲砜霉素、氟苯尼考或盐酸多西环素，治疗该患病中华草龟眼部。