张乐乐, 楚艳艳, 杨 欧, 汪菲菲, 刘生杰

(1.阜阳师范大学 生物与食品工程学院,安徽 阜阳 236037;2.阜阳师范大学 信息工程学院食品系,安徽 阜阳 236041;3.安徽农业大学 茶与食品科技学院,安徽 合肥 230036)

皇冠梨主要产自河北赵县,果实椭圆、果肉细腻多汁、风味酸甜,含有多种组生态与纤维素,适合加工果汁饮料.同时,皇冠梨具有补充营养利尿、清心润肺等功效.以加工过程中产生的梨皮和梨核为原料进行再开发,不仅能够增加附加经济效益,而且可以减少环境污染.熊果苷是绿色植物中天然存在的糖苷类物质,具有抗微生物、抗氧化、抗炎活性[1].梨皮中含有丰富的熊果苷[2],梨中主要的多酚物质是熊果苷和儿茶素[3],其中熊果苷能迅速深入肌肤,有效抑制酪氨酸酶活性、黑色素合成和皮肤色素沉积,对色斑和雀斑有明显的去除效果,在化妆品中有广泛应用[4].通过对梨渣中的熊果苷进行提取和纯化,为提高梨渣的附加价值提供参考依据.

1 实验材料

1.1 实验材料与试剂

梨渣:新鲜的皇冠梨榨汁后废弃梨皮、梨核,置于干燥箱60 ℃至恒重,用粉碎机粉碎至粉末,过40目筛后备用.熊果苷标准品(arbutin),分析纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;酪氨酸酶,无水乙醇,分析纯,天津市永大化学试剂有限公司;无水甲醇,色谱纯,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;乙酸乙酯,色谱纯,西陇科学股份有限公司;HPD100大孔吸附树脂,东鸿化工有限公司;D101大孔吸附树脂,北京索莱科技有限公司;AB-8大孔吸附树脂,广州韦伯科技有限公司;还有其他常见玻璃仪器.

1.2 实验仪器

RE52CS旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;DGT-G电热鼓风干燥箱,合肥华德利科学器材有限公司;LC-16高效液相色谱仪,岛津仪器苏州有限公司;超声波清洗机,上海声彦超声波仪器有限公司;还有其他常见玻璃仪器.

1.3 实验方法

1.3.1 熊果苷的提取

分别称取适量梨皮、梨核、梨肉等样品,按料液比1∶10(g/mL)分别加入无水乙醇,静置过夜.然后超声1 h,过滤得到熊果苷提取液,共过滤两次.将两次滤液合并后定容至50 mL,重复3次,备用.

1.3.2 熊果苷含量分析

(1)标准品溶液的制备.精确称取0.000 7 g熊果苷标准品溶解于1.00 mL甲醇溶液作为储备液,然后用甲醇逐级稀释,分别配制成浓度依次为0.75、1.5、3、6、12、24 μg/mL的标准溶液,备用.

(2)待测品溶液的制备.采用1.3.1的实验步骤得到滤液,分析备用.

(3)液相色谱条件.固定相:色谱柱WondaSil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相∶水—甲醇(体积比)=9∶1.流速0.5 mL/min.柱温30 ℃.检测波长:220 nm.进样量:5 μL.

(4)标准曲线的绘制.根据熊果苷标准品的高效液相色谱图,以熊果苷浓度对峰面积作图,可得线性回归方程,计算出梨皮、梨肉和梨核中的熊果苷含量.

1.3.3 方法学评价

(1)加标回收率.在样品中分别加入高、中、低三个浓度标准储备液,配置成加样回收液,经平行提取,检测含量并计算回收率.

(2)精密度实验.取12 μg/mL的标准品溶液,按照1.3.2色谱条件,检测6次,计算标准相对偏差(RSD).

1.3.4 大孔树脂对熊果苷分离纯化的影响

(1)大孔树脂的预处理.分别取适量的AB-8 、HPD100和D101三种型号的大孔树脂,活化后湿法上柱.经计算一个柱体积(BV)约为15 mL.

(2)三种大孔树脂对梨渣中杂质的吸附情况.将浓缩好的梨渣样品上样后,用不同浓度的乙醇溶液(0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)进行洗脱,洗脱体积为2 BV.所得流份按洗脱液分成若干等量样品,进行薄层色谱检测和高效液相色谱检测.

(3)薄层色谱检测.选用硅胶G254板为固定相,以乙酸乙酯∶甲醇(体积比)=3∶1为展开剂,在室温下上行展开,取出,晾干,置碘蒸气中熏蒸5 min后取出,在日光下检视.

(4)高效液相色谱检测.取经过三种大孔树脂纯化后效果最好的流份各1.00 mL,按照1.3.2色谱方法进行检测.

1.3.5 酶活测定

酪氨酸酶活性抑制检测方法,参照文献[5]的实验方法略做修改,反应体系组成见表1.依次添加溶液置于96孔板混匀,保温30 ℃静置2 h,然后于475 nm处测吸光度,每组平行实验3次.酶活抑制率的计算公式为

式中,A1、A2、A3、A4分别表示反应体系1、2、3、4在475 nm处测得的吸光度.同时用含5%(质量浓度)烟酰胺的小白瓶(OLAY)作对照组.

表1 反应体系组成

1.3.6 数据分析

所有数据重复3次,用“平均值±标准差”表示.采用Origin Pro 8.6软件绘图分析.

2 结果与讨论

2.1 梨渣中熊果苷含量分析

液相色谱法主要是依据保留时间和峰面积来定性定量检测目标物[6].按照1.3.2的方法,利用高效液相色谱法鉴定梨渣提取物中的成分,结果如图1所示.A图是梨渣提取物的色谱图,目标物质的出峰时间是10.322 min. B图是熊果苷标准品的色谱图,出峰时间是10.307 min.比较两者的保留时间,可以确定梨渣中含有熊果苷.

图1 梨渣提取物与熊果苷标准品液相色谱图

图2 梨不同部位熊果苷含量比较

根据熊果苷的浓度与峰面积之间的关系,得到标准曲线y=14170x+5044.3,R2=0.998 3.可以看出,熊果苷在0.75～24 μg/mL范围内的线性关系良好.皇冠梨不同部位的熊果苷含量见图2.结果发现,发现梨皮中熊果苷的含量为22.85±1.67 μg/g,梨肉为5.05±1.12 μg/g,梨核为8.42±0.60 μg/g,在梨皮中的熊果苷含量最多,其次是梨核,梨肉最低,结果与文献[7]结果是一致的.郭静[8]研究指出,熊果苷易溶于水可能与熊果苷的运输有关,熊果苷在梨树体内合成后,因其溶解性可能会造成随着水分的运输表现出分布不均匀现象.果皮是熊果苷含量最高的部位,可能是由于梨果皮存在蒸发现象,使得果实内的熊果苷向外缘富集所导致[9].

2.2 方法学评价

2.2.1 加标回收率

在样品中分别加入高、中、低三个浓度的标准储备液,配置成三种不同浓度的加样回收液,按照上述条件进行分析,对添加3、6、12 μg/mL三个水平的梨皮中的熊果苷做样品加样回收实验,平均加标回收率为97.22%、100.83%、100.44%,相对标准偏差(RSD)分别为1.42%、1.19%、1.96%,均小于2%,说明检测的结果准确可靠.

2.2.2 精密度实验

取12 μg/mL的熊果苷标准品溶液,按照上述高效液相色谱的条件,连续进样6次进行实验.计算相对标准偏差(RSD)=1.08%,说明精密度良好.

2.3 大孔树脂分离纯化效果

2.3.1 薄层色谱结果

将样品经过大孔树脂纯化的不同流份进行薄层层析,三种型号的大孔树脂纯化结果见图3～图5.图3是梨渣浓缩样品经过AB-8大孔树脂分离纯化后的薄层色谱图.其中1-13号为13个流份,14号是熊果苷标准品.可以看出,熊果苷的Rf=0.85,其中1-6号流份杂质较多;相比而言,7号流份的分离效果比较理想,含有的杂质较少,而8-13号流份拖带现象严重.图4是梨渣浓缩样品经过HPD100大孔树脂分离纯化后的薄层色谱图.1-13号为13个流份,14号是熊果苷标准品.可以看出,相比而言,4号流份的纯化效果比较理想.

图3 AB-8大孔树脂分离后的流份薄层色谱图 图4 HPD100大孔树脂分离后的流份薄层色谱图

图5 D101大孔树脂分离后的流份薄层色谱图

图5是梨渣浓缩样品经过D101大孔树脂分离纯化后的薄层色谱图.其中,1-13号为13个流份,14号是熊果苷标准品.可以看出,5号流份的纯化效果最好.6～12号流份可以检出熊果苷,但是由于其他杂质的影响,拖尾比较严重.

比较以上不同薄层色谱板的分离纯化效果,发现大孔树脂AB-8分离得到的7号流份、大孔树脂HPD100的4号流份、大孔树脂D101的5号流份的纯化效果比较理想,经高效液相色谱法进一步验证,筛选出最佳分离效果的大孔树脂.

2.3.2 高效液相色谱分析结果

将大孔树脂AB-8分离得到的7号流份、大孔树脂HPD100的4号流份、大孔树脂D101的5号流份进行高效液相色谱分析,结果见图6.A图是AB-8的7号流份,B图是HPD100的4号流份,C图是D101的5号流份,根据高效液相色谱检测得出的色谱图结果,对比分析后得出D101的纯化效果最好.

图6 三种型号大孔树脂的色谱图

D101是非极性树脂,AB-8树脂属于弱极性,HPD100属于非极性树脂[10].三种型号的大孔树脂具有适中的孔径和较大的比表面积,属于弱极性树脂,可以有效减少对极性杂质的吸附.通过对比,D101型号的大孔树脂纯化后的流份经过高效液相色谱分析,与前两者相比,杂质去除效果明显,分离纯化效果最好.

2.4 测定酶活实验结果

依据1.3.5实验方法添加样品于96孔板后,2 h后用酶标仪测定熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制情况.配制3组平行实验,利用相关数据经计算得出,大孔树脂D101分离纯化的5号流份对酪氨酸酶的抑制率为39.70±0.99%,5%烟酰胺的抑制率为57.20±0.19%.纯化的熊果苷对酪氨酸抑制率低于5%烟酰胺的酶活抑制率,主要是由于提取的样品中含有少量的杂质,但是美白活性及其作用机理还需要进一步研究.

3 结论

以皇冠梨为原料提取熊果苷,利用高效液相色谱法检测出梨皮、梨核、梨肉中熊果苷的含量分别为22.85±1.67 μg/g, 8.42±0.60 μg/g,5.05±1.12 μg/g.对比AB-8、HPD100和D101三种型号的大孔树脂对梨渣中熊果苷的纯化效果,发现大孔树脂D101的分离纯化效果最好,其中5号流份的纯度较高,其对酪氨酸酶的抑制率为39.70±0.99%,低于5%烟酰胺的抑制率57.20±0.19%.研究成果为后续的梨渣分离纯化工艺提供了较好的实验依据,也为其在美白领域的应用提供了思路和方法.