林 洋,秦淑杰,崔亚微,,朱海明,顾 湘,王效禹,刘 艳,赵 斌,刘明春,韩业东,曹艳子*

(1.大连三仪动物药品有限公司,辽宁大连 116036;2.沈阳农业大学,辽宁沈阳 110061;3.大连市农业行政执法大队,辽宁大连 116001;4.义县种畜禽监督管理站,辽宁义县 121000;5.辽宁省农业发展服务中心,辽宁沈阳 110033)

近年来,随着畜牧业的快速发展,人畜争粮、饲料转化率低、环境污染等问题已成为影响养殖业发展的瓶颈问题,寻找新的抗生素替代品成为亟待解决的问题。据报道贝莱斯芽孢杆菌可以改善动物机体肠道微生物菌群结构[1]。Feedap等[2]报道贝莱斯芽孢杆菌可用作饲料添加剂,其发酵产生的胞外抗菌物质可以抑制大肠杆菌、沙门氏杆菌和痢疾杆菌等致腹泻病原菌的生长,且抗逆性好;贝莱斯芽孢杆菌能抑制黄曲霉孢子生长、禾谷镰刀菌生长[3-4];贝莱斯芽孢杆菌对大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门菌有拮抗效果[5];贝莱斯芽孢杆菌能提高猪的平均日增重,降低发病率,促进生长性能的提高[6];贝莱斯芽孢杆菌胞外产物能抑制大肠埃希菌的活性。叶淼[7]研究发现贝莱斯芽孢杆菌可以提高蛋鸡的产蛋率、平均日采食量、蛋壳强度,增加蛋黄重量,降低血清中的促胰液素和胆囊收缩素含量。王在贵等[8-9]研究发现贝莱斯芽孢杆菌制剂可以提高鹅、雏鸡的免疫器官指数,提高免疫效果,大幅度提升家禽的生长性能。这暗示该菌对于预防鸡的食源性病原菌具有较好的应用潜力。由于该菌可产生不同酶类,因此在抑菌、提高家禽生产性能以及作为抗生素替代物方面具有很大的潜能。笔者将对分离的贝莱斯芽孢杆菌作为饲料添加剂,研究其对肉鸡生产性能和体内霉菌毒素代谢的影响,旨在为该菌在畜禽养殖领域的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试验动物。白羽肉鸡(45 000羽,健康雏鸡),购自山东某规模化肉鸡养殖场。

1.1.2菌株与试材。贝莱斯芽孢杆菌BLS-1,由大连三仪生物工程研究所保藏。可溶性淀粉购自潍坊盛泰药业有限公司;玉米赤霉烯酮(ZEN)、呕吐毒素(DON)、黄曲霉毒素(AFB1)和伏马毒素(FB)ELISA检测试剂盒均购自北京亿森宝生物科技有限公司。

1.1.3主要设备。便携式pH计(型号为Seven2Go),梅特勒托利多科技(中国)有限公司;离心机(型号为TGL16B型),上海安亭科学仪器厂;电子天平(型号为BS210S),北京泰克仪器有限公司;超纯水机(型号为UP900),韩国Human公司;管式离心机(型号为GQ75-J),辽阳中联制药机械有限公司;酶标仪(型号为FC),赛默飞世尔(上海)仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1试验设计及方法。整个饲养期均饲喂常规饲料。对照组正常饲喂,每日饮水中添加可溶性淀粉200 g,试验 Ⅰ 组1 t饮用水含BLS-1菌200×1010CFU,试验Ⅱ组1 t饮用水含BLS-1菌100×1010CFU,每日添加饮用水中饲喂,常规免疫。

1.2.2日粮组成。雏鸡(1～21日龄)、中鸡(22-35日龄)、大鸡(36-42日龄)日粮组成和营养水平见表1～2。

表1 不同日龄肉鸡的日粮组成

表2 不同日龄肉鸡的营养水平

1.2.3试验动物及其分组。试验在山东某规模化肉鸡养殖场进行,试验期42 d,随机分为对照组、试验 Ⅰ 组、试验 Ⅱ 组,每组15 000 羽,共3个重复,每个重复5 000 只鸡。

1.2.4检测指标与方法

1.2.4.1生长性能的测定。在试验初分点取样测定整群初重(图1),共取2次,每点选取20只鸡,统计整群重量;试验末体重按最终整群出栏重量记录。试验期间,认真记录各组鸡只死淘情况及饲料投放情况(记录投放饲料重量及下次投放前剩余饲料重量),试验鸡禁食12 h后测定并记录空腹初体重;以组别为单位,记录耗料量;每周试验结束后回收全部剩余饲料并记录回收料重;统计整个试验期试验鸡耗料量,即每只鸡每天消耗饲料的平均重量;在整个试验期间注意观察各组鸡的体况,详细记录死亡情况,包括死亡日期、死亡只数和组别等;试验结束后,计算各组消耗饲料平均重量、试验末平均体重、死淘率、料肉比及平均日增重。

图1 四点取样法示意Fig.1 Four-point sampling method

计算公式如下:消耗饲料平均重量(kg/只)=(投料重-回收料重)/只数×饲养天数;试验末平均体重(kg/只)=试验末整群体重/试验末存活鸡数;死淘率(%)=(试验初存活鸡只数-试验末鸡只数)÷试验末鸡只数×100%;料肉比=消耗饲料均重/增重均重;平均日增重(kg)= (试验末体重-试验初体重)/测定天数。

1.2.4.2粪便中霉菌毒素含量的测定。整个试验期内,各组分别于1、7、14、21、28、35和42日龄鸡舍内不同位点取试验动物排泄新鲜粪便约500 g,样品取出后冷冻保存,分批次对检测样本进行40～50 ℃烘干,用粉碎机破碎后置于密封袋待测。利用ELISA检测试剂盒对粪便样品中黄曲霉毒素(AFB1)、伏马毒素(FB)、呕吐毒素(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)的含量进行检测,确定不同时间段霉菌毒素代谢后排出情况。

1.2.5数据统计与分析。采用Microsoft Excel软件对试验数据进行整理,采用SPSS 17.0软件进行方差分析和多重比较,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著,数据均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 添加不同水平贝莱斯芽孢杆菌制剂对肉鸡生长性能的影响按照试验设计及饲养管理方式开展试验,添加不同水平贝莱斯芽孢杆菌制剂对肉鸡生长性能的影响见表3。

表3 不同水平贝莱斯芽孢杆菌制剂对肉鸡生长性能的影响

由表3可知,试验Ⅰ、Ⅱ组的试验末平均体重显著高于对照组(P<0.05),死淘率和料肉比显著低于对照组(P<0.05);试验Ⅰ、Ⅱ组平均日增重显著高于对照组(P<0.05);3组间消耗饲料平均重量差异不显著(P>0.05)。

2.2 添加不同水平贝莱斯芽孢杆菌制剂对肉鸡粪便中霉菌毒素含量的影响取样后的粪便经过干燥、粉碎后测定其霉菌毒素含量,添加不同水平贝莱斯芽孢杆菌制剂对肉鸡粪便中霉菌毒素含量的影响见表4。

表4 不同水平贝莱斯芽孢杆菌制剂对肉鸡粪便中霉菌毒素含量的影响

如表4所示:7～42日龄,试验Ⅰ组肉鸡粪便样品中黄曲霉毒素(AFB1)的含量低于对照组;7～21日龄,试验Ⅰ组肉鸡粪便中呕吐毒素(DON)含量低于对照组;14～42日龄试验Ⅰ组肉鸡粪便中玉米赤霉烯酮(ZEN)含量低于对照组。

3 讨论

3.1 贝莱斯芽孢杆菌制剂对肉鸡生产性能的影响在畜禽养殖中降低生产成本非常重要,而提高生长性能和饲料消化率能有效降低生产成本。芽孢杆菌在肠道中定殖后能分泌各种消化酶,产生各种营养物质,促进小肠蠕动,改善肠道功能[8-9]。陈龙等[10]开发一种贝莱斯芽孢杆菌157,通过工艺优化后产出的内切纤维素酶(CMcase)产量高且对pH具有良好的稳定性,可作为饲料添加剂用于畜禽养殖。钟丽娟等[11]研究发现饲用贝莱斯芽孢杆菌可产生淀粉酶、纤维素酶等多种酶,具有良好的生物安全性,在生物饲料领域具有较大的开发潜力。结合已有文献对贝莱斯芽孢杆菌的产酶情况进行研究,初步证实此菌在提高饲料消化率及生产性能、降低料肉比方面具有较大的潜力。该研究结果表明试验Ⅰ、Ⅱ组每只肉鸡整个试验期内消耗饲料平均重量与对照组差异不显著(P>0.05);试验Ⅰ、Ⅱ组试验末平均体重约2.5 kg,与对照组差异显著(P<0.05);试验Ⅰ、Ⅱ组肉鸡死淘率与对照组差异显著(P<0.05),死淘率比对照组分别降低3.00和1.30百分点;试验Ⅰ、Ⅱ组料肉比分别为1.77和1.80,比对照组分别降低0.08和0.05;试验Ⅰ、Ⅱ组平均日增重显著高于对照组(P<0.05)。

该研究结果表明饲料中添加贝莱斯芽孢杆菌能够提高肉鸡生长性能,降低料肉比。张静博等[12]研究发现在肉鸡饲料中添加枯草芽孢杆菌可以降低平均日采食量,提高肉鸡的生产性能。叶淼[7]研究发现添加贝莱斯芽孢杆菌在蛋鸡饲料中能够在一定程度上替代饲用抗生素使用。以上研究结果均表明芽孢杆菌在家禽养殖中具有提高生产性能的作用以及替代抗生素使用的潜力。贝莱斯芽孢杆菌作为一株新开发应用于畜禽养殖的菌株,具有强耐受性。

关于贝莱斯芽孢杆菌对肉鸡养殖的影响研究报道较少,此菌可产生丰富的次级代谢产物(如酶、抗菌物质、植物激素等)[7]。贝莱斯芽孢杆菌产生的酶类可作为外源酶,协助内源酶对饲料的消化吸收,同时可产生抑菌作用。这些次级代谢产物可以改善畜禽肠道环境、提高有益菌的相对丰度及调整菌群结构,进而调控机体的免疫系统[8-9],降低疾病发生率,由此可见该菌在提高畜禽生产性能、降低疾病感染方面具有一定的研究和应用潜力。

3.2 贝莱斯芽孢杆菌制剂对肉鸡粪便中霉菌毒素含量的影响霉菌毒素严重威胁人类和动物的健康,大多数霉菌随着畜禽的采食而进入体内,其产生的霉菌毒素30 min内就会释放到消化道中。小肠是营养成分的主要吸收地点。霉菌毒素会破坏消化道完整的屏障结构,损伤消化道黏膜,严重影响营养物质在肠道内的吸收,并为病原微生物入侵机体打开大门,进而影响机体健康。霉菌毒素对谷物和饲料的污染以及对膳食暴露的风险和毒素限量标准等,也受到世界有关部门和科研机构的高度重视,研究人员对霉菌及其毒素给动物生产和人类健康带来的不良影响做了大量研究。霉菌毒素对肉鸡养殖的影响包括生长迟缓、对免疫系统及机体各系统的损伤严重等[12-14]。目前贝莱斯芽孢杆菌的分离及其对霉菌毒素降解的研究尚处于初级阶段,寻找一种高效、安全、环保的霉菌毒素生物降解方法成为研究热点[11,15]。

利用酶联免疫吸附试剂盒每周检测粪便样本中4种毒素的含量,发现试验Ⅰ组14～21日龄鸡粪便样品黄曲霉毒素(AFB1)、呕吐毒素(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)的含量比对照组低,表明饲喂添加该菌剂能够降低霉菌毒素对动物机体内代谢的影响。这与王晓敏等[16]的研究结果相一致。王明清等[17]分离筛选出一株贝莱斯芽孢杆菌,其胞外上清液、菌悬液和胞内液分别能降解90.6%、19.6%和12.8%的AFB1,而笔者通过体外临床试验证实了贝莱斯芽孢杆菌菌剂对AFB1的降解能力。赖根生等[18]研究发现可降解DON的贝莱斯芽孢杆菌在1 μg/mL的DON下摇瓶发酵16 h对DON的降解率达82.63%,可与乳酸菌协同去除饲料中的呕吐毒素。曹荣耀等[4]从猪肠道中分离出一株贝莱斯芽孢杆菌,其发酵上清液在72 h内能降解76.7%的DON。笔者通过添加贝莱斯芽孢杆菌制剂的肉鸡体外临床试验,从实际临床角度证实了贝莱斯芽孢杆菌制剂对霉菌毒素的降解能力。7～42日龄,试验Ⅰ组肉鸡粪便样品中黄曲霉毒素(AFB1)的含量低于对照组,可见饲喂该菌剂能减少黄曲霉毒素在动物机体内的代谢排出量,原因可能是该菌及其代谢产物对黄曲霉毒素发挥了降解作用。1、7、21、28、42日龄试验Ⅱ组肉鸡粪便中的伏马毒素(FB)含量低于对照组,饲喂该菌剂对肉鸡粪便中伏马毒素(FB)的作用效果需要进一步验证。7～21日龄,试验Ⅰ组肉鸡粪便中呕吐毒素(DON)含量低于对照组,说明该菌剂可能具有降低呕吐毒素代谢量的作用。14～42日龄试验Ⅰ组肉鸡粪便中玉米赤霉烯酮(ZEN)含量低于对照组。

该试验中测定了饲料中4种霉菌毒素的含量,但是试验前后的检测值基本一致,故不做考察。对于该试验中可能存在霉菌毒素残留于机体肌肉、脏器及肠道中的问题,该试验所有组别养殖及饲养条件均一致,因此排除了其他因素对霉菌毒素代谢含量的影响。该研究中饲喂贝莱斯芽孢杆菌可以促进肉鸡生长,降低死淘率以及对霉菌毒素代谢的影响,可能是由于微生物发酵过程中可产生多种酶类,这些酶类可以促进生长、提升免疫力,进而促进消化吸收,减少动物毒素的摄入,进而降低通过食物链对人体的损伤和毒性。其降解机制还需要深入探讨,未来通过基因工程及分子生物学方法构建和改造菌株,筛选或克隆出表达高产降解酶的菌株,以实现其在畜牧养殖业中的推广应用。

4 结论

该试验条件下饲喂贝莱斯芽孢杆菌制剂能够显著提高试验肉鸡的试验末平均体重,降低肉鸡死淘率及料肉比,降低饲养成本,减少黄曲霉毒素(AFB1)、伏马毒素(FB)、呕吐毒素(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)在粪便中的代谢排出量。综合考虑指标效果,推荐试验 Ⅰ 组添加BLS-1菌200×1010CFU/t作为最佳用量。