周秀娟,梁倩蓉,朱凝瑜,丁雪燕,朱 斐*

(1.浙江农林大学动物科技学院·动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程实验室,浙江杭州 311300;2.浙江省水产技术推广总站/浙江省渔业检验检测与疫病防控中心,浙江杭州 310023)

中华鳖因其具有较高的经济价值而成为我国重要的淡水养殖品种之一。中华鳖营养丰富、肉味鲜美,具有较高的食用与药用价值[1-4],养殖分布广泛,湖南、湖北、江西、安徽、江苏、浙江等省份产量较高[5-6]。浙江省中华鳖养殖品系众多,包括中华鳖日本品系、清溪乌鳖等,并自主繁育了中华鳖“浙新花鳖”(GS-02-005-2015)等。然而,近年来中华鳖病害发生较多,导致养殖损失惨重。目前已报道的中华鳖病害包括病毒病、细菌病、真菌病和寄生虫病,其中病毒病和细菌病较为严重[7-9]。目前已知的中华鳖病毒主要有动脉炎病毒、黄病毒、虹彩病毒等[10-11],细菌病病原主要为气单胞菌和弧菌[12-13]。

2021年5月,浙江省诸暨市某养殖场出现中华鳖大量死亡病例。笔者实地采集该养殖场患病中华鳖,进行组织解剖、平板划线分离优势菌,并通过细菌生理生化试验和病毒分子生物学分析的方法进行分类鉴定,再通过药敏试验筛选出能有效抑制病原菌的抗菌药物,最后提出合理防控建议,旨在为中华鳖腮腺炎的科学诊断和防控提供基础支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1试验动物。浙江诸暨某中华鳖养殖场出现连续性死亡,病鳖行动迟缓,脖颈肿大且无法缩回壳内,底板发白,底板和四肢病鳖行动迟缓、少食厌食,脖颈肿大、无法缩回壳内,底板和四肢有明显出血点或斑块。取该养殖场5只患病中华鳖作为试验动物。

1.1.2主要试剂。营养琼脂培养基、脑心浸出液购自青岛海博生物技术有限公司;96孔药敏板购自南京菲恩医疗科技有限公司;RNA提取试剂盒、DNA提取试剂盒、PCR相关试剂均购自上海捷瑞生物工程有限公司;特异性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3主要仪器。全自动细菌生理生化鉴定仪(VITEK2 Compact,法国梅里埃);PCR仪(Arktik96,美国Thermofisher);多功能电泳仪(PowerPac HC,美国Bio-Rad);低温冷冻离心机(Microfuge 20R,美国Beckman Coulter)等。

1.2 病鳖解剖与病原分离选取症状典型的濒死病鳖,无菌条件下使用接种环从其腮腺、肝、脾、肾、肠等病灶部位蘸取划线接种于营养琼脂培养基,28 ℃下培养过夜,挑取形态一致的优势菌落进行纯化培养,直至获得纯培养菌(编号为SR1),保存在含20%甘油的脑心浸出液中,置于-80 ℃冰箱中保存。取肝、肾、脾等内脏组织保存于DNA/RNA保护液中,用于病毒检测。

1.3 细菌鉴定将纯化的细菌进行革兰氏染色,根据染色结果选择相应鉴定卡,用无菌生理盐水将细菌浓度调至107～108CFU/mL,插上鉴定卡,放入全自动细菌生理生化鉴定仪中培养鉴定。

1.4 病毒检测利用RNA、DNA提取试剂盒分别提取病鳖肝、脾、肾组织RNA和DNA,利用中华鳖出血性综合征病毒(TSHSV)、虹彩病毒(STIV)和黄病毒(FLV)3种已知中华鳖病毒特异性引物(引物见表1,引物参考Liu等[14]、范万红等[15]报道以及经NCBI网站序列信息设计),进行PCR扩增。经1%的琼脂糖凝胶电泳初步判定扩增产物为目的条带大小附近的单一条带后,胶回收产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

表1 病毒特异性引物对

将测序所得的病毒序列在GenBank数据库中进行Blast比对,选取相似度高的序列,使用Clustal X进行多重序列同源性比对,使用MEGA 8.0软件采用邻接法(NJ法)构建系统进化树。

1.5 药敏试验采用微量肉汤连续稀释法进行药敏试验。纯化的菌落用无菌生理盐水将浓度调至107～108CFU/mL,稀释后加入96孔药敏板,28 ℃下培养24～28 h后读板。根据培养后96孔药敏板的浊度,确定恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、盐酸多西环素、氟甲喹、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶8种渔用抗菌药物对菌株的最低抑菌浓度(MIC值),统计8种抗菌药物对病原菌的MIC50和MIC90。

1.6 回归感染试验

1.6.1出血性综合征病毒人工感染。按照Liu等[9]的方法,取病鳖肝、脾、肾等组织加入无菌生理盐水(质量体积比1∶10)充分研磨后12 000 r/min、4 ℃下离心10 min,取上清液经0.22 μm滤膜过滤,并将其作为病毒粗提液进行攻毒。在(25±1)℃水温条件下,对20只平均质量300 g的健康中华鳖进行腹腔注射,每只鳖注射200 μL病毒粗提液(试验组),以等体积无菌生理盐水注射20只相同规格的中华鳖作为对照组,观察记录2组中华鳖的死亡数量,并统计累计死亡率。取感染中华鳖肝、脾、肾等组织提取核酸,进行PCR扩增,方法同“1.4”。

1.6.2嗜水气单胞菌人工感染。取分离菌株接种于脑心浸出液,30 ℃下培养24 h,5 000 r/min离心并去除培养液后,无菌生理盐水重悬并调节浓度至107CFU/mL。在(25±1)℃水温条件下,对20只平均质量300 g的健康中华鳖进行腹腔注射,每只鳖注射200 μL细菌悬液(试验组),用等体积无菌生理盐水注射20只相同规格的中华鳖作为对照组,观察记录2组中华鳖的死亡数量,并统计累计死亡率。从感染中华鳖腮腺、肝、脾、肾等部位蘸取划线培养并鉴定,方法同“1.2”和“1.3”。

2 结果与分析

2.1 病鳖临床症状和剖检结果病鳖行动迟缓、少食厌食,脖颈肿大、无法缩回壳内,发白的底板和四肢有明显出血点或斑块。经解剖可见,病鳖腮部出现糜烂及出血,肝脏肿胀,肠道充血明显,伴有腹水(图1)。

注:A.脖颈浮肿,底板有血斑;B.肠道充血;C.腮部糜烂及出血;D.腹水。Note:A.Puffy neck,blood stains on the abdomen;B.Intestine hyperemia;C.Parotid erosion and bleeding;D.Ascites.图1 病鳖临床症状及病理变化Fig.1 The symptoms and pathological changes of diseased T.sinensis

2.2 细菌分离与生化鉴定从患病中华鳖腮腺、肝、脾、肾、肠组织中均分离到一种主要优势菌,菌落呈圆形,边缘完整,中央有突起,表面光滑,浅黄色,半透明,革兰氏染色呈阴性(图2)。基于全自动细菌生理生化鉴定仪鉴定结果,该优势菌为嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila),菌株相似性为99%。该优势菌生理生化特性见表2。

图2 病鳖优势菌的分离与纯化Fig.2 The separation and purification of the dominant colonies from diseased T.sinensis

表2 病原菌生理生化特性

2.3 病毒分子生物学鉴定利用3种中华鳖常见病毒特异性引物进行病毒检测,其中STIV、FLV特异性引物未扩增到条带;TSHSV引物扩增获得长度约308 bp的片段(图3)。产物切胶回收测序,序列经Blast比对分析发现其与中华鳖出血性综合征病毒(TSHSV)同源性为96.84%。从GenBank数据库中下载动脉炎属病毒和中华鳖其他病毒序列,构建系统进化树。结果显示,此次分离病毒与TSHSV聚为一支(图4)。

注:M.DNA Marker;L1.肝;L2.肾;L3.脾。Note:M.DNA Marker;L1.Liver;L2.Kidney;L3.Spleen.图3 患病中华鳖不同组织病毒PCR扩增片段琼脂糖凝胶电泳结果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of PCR fragments of the virus from different tissues of diseased T.sinensis

图4 患病中华鳖病毒分离株系统进化树分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of the isolated virus from diseased T.sinensis

2.4 药敏试验96孔药敏板试验结果(表3)显示,病鳖体内分离的嗜水气单胞菌对恩诺沙星、硫酸新霉素和盐酸多西环素3种抗菌药物敏感(MIC50≤2 μg/mL,MIC90≤4 μg/mL),而对氟苯尼考、甲砜霉素、磺胺间甲氧嘧啶钠和磺胺甲噁唑/甲氧苄啶4种抗菌药物耐受(MIC50≥128 μg/mL,MIC90≥128 μg/mL)。

表3 8种渔用抗菌药物对中华鳖嗜水气单胞菌的MIC值

2.5 回归感染后中华鳖累计死亡率从图5可以看出,出血性综合征病毒人工感染中华鳖2 d内未出现明显死亡,3 d后死亡率明显增加,感染第6天试验组中华鳖全部死亡,对照组中华鳖均未死亡。经解剖发现,试验组中华鳖出现腹腔血水、腮出血、肝脏发黑、肠道红肿等症状。感染后中华鳖肝、脾、肾等组织TSHSV检测呈阳性。

图5 出血性综合征病毒人工回归感染中华鳖累计死亡率Fig.5 Accumulative mortality of T.sinensis artificially infected by TSHSV

嗜水气单胞菌人工感染中华鳖第2天开始出现死亡,此后死亡率明显增加,感染第6天试验组中华鳖累计死亡率高达60%,对照组中华鳖均未出现死亡(图6)。经解剖发现,试验组中华鳖出现肝脏发黑、肠道红肿、腹腔血水等主要症状。从感染中华鳖腮腺、肝、脾、肾分离的细菌经鉴定为嗜水气单胞菌。

图6 嗜水气单胞菌人工回归感染中华鳖累计死亡率Fig.6 Accumulative mortality of T.sinensis artificially infected by Aeromonas hydrophila

3 讨论

中华鳖出血性综合征病毒(TSHSV)能引起中华鳖腮腺红肿、内脏器官病变和全身性出血,是一种感染性强、致死率高的动脉炎病毒[16]。其典型临床症状为腮腺糜烂红肿,肝脏组织肿大质脆、点状严重充血,肠道红肿出血。2015年,中华鳖出血性综合征病毒序列首次被浙江省淡水水产研究所刘莉团队报道[14],随后感染该病毒中华鳖的组织病理学特征[17]、组织差异蛋白质组学和腮腺差异转录组学被逐一分析研究[7,9]。同时,丁军等[18]利用光镜和电子显微镜观察海龟肝脏和肾脏的组织病理学特征,结果与中华鳖出血性综合征病毒感染相似,说明海龟也存在被该病毒感染的潜在可能。上述报道为中华鳖出血性综合征病毒感染特性研究提供了有力参考,近年来学者们对该病毒的关注度有所提高。

气单胞菌属是一类革兰氏阴性条件致病菌,广泛存在于自然界中,可引起水生动物出现溃疡、疥疮、败血等病症,并能在一定条件下导致人急性肠炎乃至严重的腹膜炎以及骨髓炎等[19]。常见致病气单胞菌包括嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌等,可感染草鱼、鲆鲽类、中华绒螯蟹等多种常见水产经济品种[20-22],也能引起中华鳖多种病症,包括鳖红脖子病、腮腺炎、白底板、红底板、出血性肠道坏死症、腐皮病等[23]。

根据疾病流行病学特征,笔者对此次患病中华鳖分别开展病毒和细菌检测,结果同时鉴定到中华鳖出血性综合征病毒和嗜水气单胞菌,并分别进行了回归感染试验,由此确定此例中华鳖腮腺炎为嗜水气单胞菌与中华鳖出血性综合征病毒混合感染所引起。此病例发病时间为5月底至6月,也是中华鳖腮腺炎的主要流行季节[24],此时养殖水温为26～30 ℃,适宜病毒和病原菌的快速生长。过高的养殖密度和不适宜的饲料投喂量引起水体中饵料残渣和粪便的过度富集,势必导致水质变差,另外也会营造病原滋生的“温床”。加上高温状态下中华鳖机体免疫力也会下降,会致使感染加剧。因此,病毒和细菌的混合感染往往是造成养殖动物高致死率的主要原因。

目前,未有针对中华鳖出血性综合征的特效治疗药物,该病防控的核心原则仍是“防重于治”。必须从优质苗种、水质调控、合理密度、日常管理等方面做到“防病于未然”,在疾病高发季节,合理使用国家批准使用的含氯石灰等消毒药物对水体定时消杀;同时也可从推广“稻鳖共生”“虾鳖混养”[25-26]等生态养殖模式、优化中华鳖养殖环境方面入手,减少病毒病的暴发。一旦发病,应首先确诊病原,及时捞出病死鳖、彻底消毒;若发现伴有细菌感染,应严格依据药敏试验结果,选择抗菌效果好的抗菌药物进行治疗,使用国家批准的中草药和维生素C等制剂拌饲投喂,对患病动物进行免疫调理,以降低死亡率、减少损失。