范佳明，徐华益，2，瞿恒贤，杭天玥，鲁茂林，刘洋，顾瑞霞，陈大卫*

（1.扬州大学 食品科学与工程学院江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室，江苏 扬州 225009；2.江苏省盐城市滨海县滨淮镇人民政府，江苏 盐城 224552）

白首乌（Cynanchum auriculatum Royle ex Wight，CaREW）为萝藦科鹅绒藤属植物[1]，不仅含有丰富的蛋白质、脂肪、淀粉、维生素、矿物质等，还含有多糖、C21甾体苷类化合物、苯乙酮类化合物及磷脂等多种功能活性物质[2-3]。研究发现，白首乌中的多糖具有较强的清除ABTS+自由基、DPPH 自由基和超氧阴离子自由基的能力，不仅能够通过氧化防御机制对细胞的氧化应激起到保护作用，还可以通过提高氧化损伤细胞中的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）的水平来改善其抗氧化能力[4]。C21 甾体苷类化合物可以通过上调细胞核因子-红细胞2 相关因子2（nuclear factor-erythroid 2 related factor 2，Nrf2）和血红素氧化酶1（heme oxygenase 1，HO-1）的表达以及抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B，NFκB）信号通路来保护细胞免受氧化毒性和炎症损伤[5]。同时，白首乌中的苯乙酮类化合物也能够通过增强细胞中SOD、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶（glu tathione peroxidase，GSH-Px）的活性来改善细胞的抗氧化能力[6]。除此之外，白首乌还具有调节机体免疫、保护机体神经、抗抑郁及辅助降血糖等功能[7-10]。

越来越多的研究表明，发酵不仅能赋予食品特有的风味，还可以增强食品的益生功能[11-13]。乳酸菌的白首乌发酵产物不仅可以通过改善小鼠血清和海马体组织中的SOD 活性来提高其抗氧化能力，还可以通过调节小鼠海马体组织的NF-κB 信号来缓解机体的认知损伤[14]，发酵后的白首乌对小鼠的免疫调节能力要优于未发酵[15]。同时，乳酸菌发酵白首乌还能提高产品中的乳酸菌活菌数以及氨基酸含量[16]，有助于增强产品的益生功能。

江苏省滨海县是我国白首乌的主要产地。近年来，由于滨海白首乌的附加值偏低，在一定程度上限制了其发展。酸乳因其发酵带来的良好的口感、营养和功能特性，是我国消费量增长速度最快的乳制品。随着人们的健康意识不断增强，具有一定功能的酸乳制品也将越来越受到人们的青睐。因此，本文以江苏省滨海县白首乌粉为研究对象，通过对滨海白首乌粉添加量、发酵剂接种量、蔗糖添加量及发酵温度进行优化，开发具有一定功能特性的酸乳产品；不仅能满足人们对功能性酸乳产品的消费需求，还能提升滨海白首乌的附加值，促进滨海白首乌产业的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

滨海白首乌粉：盐城陈氏食品有限公司；全脂乳粉：扬州市扬大康源乳业有限公司；蔗糖（食品级）：市售；商业发酵剂Y450A（嗜热链球菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种组合）：意大利萨科公司。

总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）检测试剂盒：南京建成生物工程研究所；改良（modified chalmers，MC）培养基、MRS 培养基：青岛海博生物技术有限公司；氢氧化钠、盐酸、酚酞（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高压均质机（APV-2000）：德国APV 公司；全自动灭菌锅（JF-SX-500）：日本Tony 公司；高速冷冻离心机（Legend mach1.6R）、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪（Trace DSQ）：美国Thermo Fisher Scientific 公司；生化培养箱（SPX-150BSH）：上海新苗医疗器械制造有限公司；转子粘度计（NDJ-1）：上海精天科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 滨海白首乌酸乳的制备

全脂乳粉（12%）+蔗糖+水+滨海白首乌粉→60～65 ℃溶解→200 目过筛→均质→95 ℃热处理10 min→冷却至42 ℃→接种发酵→冷却→4 ℃后熟。

1.3.2 酸乳酸度的测定

按照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》[17]的方法测定酸乳的酸度。

1.3.3 酸乳黏度的测定

利用转子黏度计，选用4 号转子，转速调制在12 r/min，样品温度4 ℃，读数时间30 s。

1.3.4 总抗氧化能力测定

总抗氧化能力测定按T-AOC 检测试剂盒的说明书进行。

1.3.5 风味物质的测定

取10.0 mL 的样品置于顶空瓶中，水浴平衡后，将已老化后的固相微萃取头插入顶空瓶中，萃取后快速进行GC-MS 测试分析。具体的测定方法、GC 条件和MS 条件参考文献[18]，风味物质的定性定量分析参考文献[19]。

1.3.6 乳酸菌活菌计数

取25.0 g 样品于225.0 mL 无菌生理盐水中，进行10 倍系列稀释至10-8。选择3 个稀释梯度，吸取1.0 mL至无菌培养板中，并加入相应的培养基，每个样品重复3 次，然后置于37 ℃培养72 h 后，测定样品中的乳酸菌活菌数，具体操作方法参考GB4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》[20]。

1.3.7 酸乳感官评价

选择10 位食品专业学生和教师组成感官评价小组，并在食品专业的感官评价实验室进行。将酸乳样品搅拌均匀后进行感官评分。每个样品评价后应以清水漱口，并间隔10 min。评价项目和评分标准见表1。

表1 酸乳感官评分标准Table 1 Standards for sensory evaluation of yogurt

1.4 滨海白首乌酸乳制备条件的优化

1.4.1 单因素试验

1.4.1.1 滨海白首乌粉添加量的筛选

分别取0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的滨海白首乌粉和6.0%的蔗糖及全脂乳粉搅拌均匀后溶解，均质、热处理及冷却后，接种0.015 U/kg 的发酵剂，42 ℃发酵5 h 后终止发酵，后熟后测定其酸度、黏度、总抗氧化能力，并进行感官评价。

1.4.1.2 发酵剂接种量的筛选

取2.0%的滨海白首乌粉和6.0%的蔗糖及全脂乳粉搅拌均匀后溶解，均质、热处理及冷却后，分别接种0.001、0.005、0.010、0.015 U/kg 和0.020 U/kg 的发酵剂进行发酵，42 ℃发酵5 h 后终止发酵，后熟后测定其酸度、黏度、总抗氧化能力，并进行感官评价。

1.4.1.3 蔗糖添加量的筛选

分别取5.0%、6.0%、7.0%、8.0%和9.0%的蔗糖和2.0%的滨海白首乌粉及全脂乳粉搅拌均匀后溶解，均质、热处理及冷却后，接种0.015 U/kg 的发酵剂，42 ℃发酵5 h 后终止发酵，后熟后测定其酸度、黏度、总抗氧化能力，并进行感官评价。

1.4.1.4 发酵温度的筛选

取2.0%的滨海白首乌粉和6.0%的蔗糖及全脂乳粉搅拌均匀后溶解，均质、热处理及冷却后，接种0.015 U/kg 的发酵剂，分别于36.0、38.0、40.0、42.0 ℃和44.0 ℃发酵5 h 后终止发酵，后熟后测定其酸度、黏度、总抗氧化能力，并进行感官评价。

1.4.2 正交试验设计

在单因素试验基础上，以滨海白首乌粉添加量（A）、发酵剂接种量（B）、蔗糖添加量（C）及发酵温度（D）4 个因素为变量进行正交优化，以总抗氧化能力为指标，优化滨海白首乌酸乳的制备条件，因素水平如表2 所示。

表2 因素水平设计Table 2 Levels of factors

1.5 统计学方法

试验数据采用SPSS21.0 软件进行分析，结果以平均值±标准差表示，差异显著性分析使用t 检验，P<0.05 判定为有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 滨海白首乌酸乳制备条件优化

2.1.1 滨海白首乌粉添加量对酸乳发酵品质和总抗氧化能力的影响

滨海白首乌粉中含有多种活性物质，其添加量对酸乳的发酵和抗氧化能力有着重要的影响，因此，本研究考察其添加量对酸乳的酸度、黏度、感官及其总抗氧化能力的影响，结果见表3。

表3 滨海白首乌粉添加量对酸乳发酵品质和总抗氧化能力的影响Table 3 Effects of Cynanchum auriculatum root powder addition on the fermentation quality and T-AOC of yogurt

由表3 可知，滨海白首乌粉添加量对酸乳的酸度影响较小；黏度和总抗氧化能力随着滨海白首乌粉添加量的增加而增加，在2.0%和2.5%时的黏度和总抗氧化能力显著高于其他添加量（P<0.05）；而感官评f 分则呈现相反的趋势，在添加量为0.5%和1.0%时的感官评分分别为93.00 和94.00，显著高于其他添加量（P<0.05）。虽然滨海白首乌粉添加量在2.5%时酸乳的总抗氧化能力最强，但其酸度和黏度较大，感官评分较低，而在0.5%时的感官评分较高，但总抗氧化能力最弱，因此，选择1.0%、1.5%和2.0%的滨海白首乌粉添加量作为正交试验的因素水平。

2.1.2 发酵剂接种量对酸乳发酵品质和总抗氧化能力的影响

发酵剂是影响酸乳酸度、感官品质及其功能的主要因素，因此本研究考察其接种量对酸乳的酸度、黏度、感官及其总抗氧化能力的影响，结果见表4。

表4 发酵剂接种量对酸乳发酵品质和总抗氧化能力的影响Table 4 Effect of starter inoculation amount on the fermentation quality and T-AOC of yogurt

由表4 可知，酸乳的酸度随着接种量的增加而增加，而总抗氧化能力随着接种量的增加呈现先增加后减小的趋势，在接种量分别为0.010、0.015、0.020 U/kg时显著高于其他接种量（P<0.05）；在接种量为0.010 U/kg和0.015 U/kg 时的感官评分分别为90.00 和89.00，显著高于其他接种量（P<0.05）；当接种量由0.005 U/kg增加至0.010 U/kg 时，酸乳的酸度、黏度、感官评分及总抗氧化能力均显著增加，而当接种量由0.015 U/kg增加至0.020 U/kg 时，酸乳的酸度和总抗氧化能力均未发生显著变化（P>0.05），而感官评分显著下降（P<0.05），因此，选择0.005、0.010、0.015 U/kg 接种量作为正交试验的因素水平。

2.1.3 蔗糖添加量对酸乳发酵品质和总抗氧化能力的影响

蔗糖通过发酵剂中的乳酸菌发酵影响着酸乳的酸度、黏度及其功能特性产生，因此本研究考察其添加量对酸乳的酸度、黏度、感官及其总抗氧化能力的影响，结果见表5。

表5 蔗糖添加量对酸乳发酵品质和总抗氧化能力的影响Table 5 Effects of sucrose addition on the fermentation quality and T-AOC of yogurt

由表5 可知，酸乳的酸度、黏度及总抗氧化能力随着蔗糖添加量的增加呈先上升后下降趋势；当蔗糖添加量为5.0%、6.0%及7.0%时，酸乳的感官评分和总抗氧化能力均处于较高的水平；而当蔗糖添加量继续增大时，酸乳的酸度、黏度及感官评分均发生了显著下降（P<0.05），因此选择添加量5.0%、6.0%和7.0%作为正交试验的因素水平。

2.1.4 发酵温度对酸乳发酵品质和总抗氧化能力的影响

发酵温度是影响酸乳品质的重要因素，因此研究了其对酸乳的酸度、黏度、感官及其总抗氧化能力的影响，结果见表6。

表6 发酵温度对酸乳发酵品质和总抗氧化能力的影响Table 6 Effects of temperature on the fermentation quality and T-AOC of yogurt

由表6 可知，发酵温度对酸乳的酸度产生了较大的影响，当发酵温度为42.0 ℃时，酸乳的酸度为90.80°T，显著高于36.0 ℃时的酸度（75.00°T）（P<0.05）；酸乳的黏度、感官评分及总抗氧化能力随着发酵温度的增加呈先上升后下降趋势；当发酵温度为40.0、42.0 ℃和44.0 ℃时，酸乳的感官评分和总抗氧化能力均处于较高的水平，因此，选择40.0、42.0 ℃和44.0 ℃作为正交试验的因素水平。

2.1.5 正交试验

根据单因素试验结果，以总抗氧化能力为指标，对滨海白首乌酸乳的制备条件进行优化，正交试验结果见表7。

表7 滨海白首乌酸乳的正交试验结果Table 7 Orthogonal testing results of Cynanchum auriculatum root-fermented yogurt

由表7 可知，从极差分析结果可以看出，对滨海白首乌酸乳总抗氧化能力影响主次顺序为A>C>B>D，即滨海白首乌粉添加量>蔗糖添加量>发酵剂接种量>发酵温度，最优发酵条件为A3B3C1D1，即滨海白首乌粉的添加量为2.0%，发酵剂接种量为0.015 U/kg，蔗糖添加量为5.0%，发酵温度为40 ℃。此条件下制备的滨海白首乌酸乳的总抗氧化能力和感官评分分别为0.129 2 mmol/L 和91.00。

2.2 滨海白首乌发酵对酸乳抗氧化能力的影响

在最优发酵条件下制备滨海白首乌酸乳，以同一条件下制备不含滨海白首乌粉的酸乳和未发酵的含相同含量的滨海白首乌粉、蔗糖和全脂乳粉的全脂乳溶液为对照，研究滨海白首乌粉的发酵对酸乳抗氧化能力的影响，结果如图1 所示。

图1 滨海白首乌酸乳的总抗氧化能力Fig.1 T-AOC of Cynanchum auriculatum root-fermented yogurt

由图1 可知，不含滨海白首乌粉的酸乳和未发酵含滨海白首乌粉的全脂乳溶液的总抗氧化能力分别为0.051 3 mmol/L 和0.061 2 mmol/L，显著低于滨海白首乌酸乳的0.129 2 mmol/L（P<0.05），嗜热链球菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵滨海白首乌粉显著提高了酸乳的抗氧化能力（P<0.05）。

滨海白首乌酸乳的总抗氧化能力不仅显著高于不含滨海白首乌粉的酸乳和含滨海白首乌粉的不发酵全脂乳液（P<0.05），也高于两者之和，表明乳酸菌发酵滨海白首乌可能具有协同增加酸乳抗氧化的效果。耳叶牛皮消中含有多糖、C21 甾体苷类化合物及苯乙酮类化合物等多种具有抗氧化功能的活性物质[2-3]；有研究表明，微生物发酵通过提高耳叶牛皮消中C21 甾体苷类化合物的含量及新增没食子酸等活性物质来增强其对机体的免疫活性[15]；因此，推测发酵剂中的嗜热链球菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种可能通过发酵增加了滨海白首乌中C21 甾体苷类化合物、苯乙酮类等抗氧化物质的含量来增强酸乳的抗氧化能力。

2.3 滨海白首乌发酵对酸乳风味的影响

在最优发酵条件下制备滨海白首乌酸乳，以同一条件下制备不含滨海白首乌粉的酸乳为对照，研究滨海白首乌发酵对酸乳风味的影响，结果如表8 所示。

表8 滨海白首乌酸乳中的风味物质Table 8 Flavor components in Cynanchum auriculatum rootfermented yogurt

从表8 可以看出，酸乳中的风味物质主要为酮类、醇类、酸类、酯类及醛类。滨海白首乌的发酵对酸乳风味物质的含量和种类具有一定影响。酸乳中风味物质的相对含量为77.14%，滨海白首乌发酵后的酸乳中风味物质的相对含量为78.31%。滨海白首乌发酵后消失的风味物质有20 种，其中酮类、醇类和酯类物质消失了13 种；滨海白首乌发酵后新增的风味物质有23 种，其中醇类、酸类、醛类和酯类物质增加了17 种。

醇类对滨海白首乌酸乳的风味贡献较大，滨海白首乌发酵使得异丙醇的相对含量由0.50%增加到13.68%，3，6，9，12-四氧杂十六烷-1-醇的相对含量由1.40%增加到7.35%，2，5，8，11，14-五氧杂-16-十六烷醇的相对含量由0.87%增加到8.99%；同时增加了1-（2-丁氧基乙氧基）-2-丙醇、2-（三甲硅基）乙醇、3-甲基-2-庚醇及2-丙氧基-2-丙醇4 种物质。

酮类在滨海白首乌酸乳的风味物质中也占有较大的比例，滨海白首乌发酵使得2，3-丁二酮的相对含量由4.25%增加到7.72%，但3-羟基-2-丁酮的相对含量由19.13%下降到0.12%，2-庚酮的相对含量由4.99%下降到2.18%，2-壬酮的相对含量由1.80%下降到0.48%。

酸类虽然在滨海白首乌酸乳的风味物质中占有的不高，但滨海白首乌发酵使得酸乳新增了硬脂酸、正十五酸、十三酸、（+/-）-2-氨基-3-羟基丁酸、十一酸、十一烯酸、3-甲基戊酸等7 种酸类物质。在其他类的风味物质中，滨海白首乌发酵使得三乙二醇单丁醚的相对含量由0.25%增加到4.14%，2，6-二叔丁基苯醌的相对含量由4.08%下降到1.70%，二乙二醇丁醚的相对含量由2.23%下降到0.15%，并使得相对含量较高的2-甲氧基-1，3-二氧戊环消失；同时，新增了辛基缩水甘油醚、甘氨酸、三乙二醇单甲醚及三乙二醇单乙醚4 种风味物质。

在所有风味物质中，异丙醇、3，6，9，12-四氧杂十六烷-1-醇、2，5，8，11，14-五氧杂-16-十六烷醇、仲丁基亚硝酸酯、2，3-丁二酮、三乙二醇单丁醚、三乙二醇单乙醚在滨海白首乌酸乳挥发性风味物质中占有较高的比例，相对于酸乳，其相对含量均具有大幅的提升。同时，虽然滨海白首乌酸乳中的正己醇和2-庚酮的相对含量由未添加滨海白首乌粉酸乳中的9.47%和4.99%分别降至6.45%和2.18%，但仍占有较高的比例。这9 种挥发性风味物质在滨海白首乌酸乳挥发性风味物质中的总相对含量达到了56.52%，对滨海白首乌酸乳的风味贡献最大，是滨海白首乌酸乳的主要风味物质。

此外，异丙醇带有酒香、果香和脂肪气息，2，3-丁二酮又称双乙酰，是酸乳中的主要特征性风味物质，滨海白首乌发酵增加了酸乳中异丙醇和2，3-丁二酮的相对含量；1-辛醇具有青草、酸败等刺激性气味，3-羟基-2-丁酮具有强烈的奶油、脂肪香气，稀释后有令人愉快的奶香气，而滨海白首乌发酵降低了酸乳中1-辛醇和3-羟基-2-丁酮相对含量，表明滨海白首乌发酵对酸乳的风味具有一定的改善作用。滨海白首乌的发酵赋予酸乳更多的风味物质和较高的含量，其风味不仅仅是风味物质种类和含量的增加与抵消，而是它们之间协同作用表现出来的综合特征。

2.4 滨海白首乌酸乳的贮藏特性

将最优条件下制备的滨海白首乌酸乳在4 ℃条件下分别贮藏0、7、9、11、13、15 d，研究贮藏过程中酸乳的酸度、感官、乳酸菌活菌数及总抗氧化能力的变化，其贮藏特性见图2。

图2 滨海白首乌酸乳的贮藏特性Fig.2 Storage characteristics of Cynanchum auriculatum rootfermented yogurt

由图2A 可知，随贮藏时间的延长，滨海白首乌酸乳的酸度呈上升的趋势，在15 d 达到最大，为129.6°T，而感官评分则呈相反的趋势，即随着贮藏时间的延长，感官评分呈逐渐下降的趋势，在15 d 时感官最差，为58；由图2B 可知，滨海白首乌酸乳的活菌数和总抗氧化能力随着贮藏期的延长呈下降趋势，在15 d 时的乳酸菌活菌数仍在107CFU/mL 以上，表明酸乳中的乳酸菌在贮藏15 d 的过程中能够保持较高的活菌数，但增加了酸乳的酸度，降低了酸乳的感官评分。

感官评价还发现，酸乳在第11 天时有少量乳清析出，较酸，感官评分低于80；同时，乳酸菌活菌数下降较快，由第9 天的1.57×108CFU/mL 降至6.37×107CFU/mL，总抗氧化能力也由0.103 5 mmol/L 降至0.091 2 mmol/L。因此，综合酸乳的感官、抗氧化能力及乳酸菌活菌数，建议滨海白首乌酸乳的货架期为9 d。

3 结论

当滨海白首乌粉的添加量为2.0%，Y450A 发酵剂的接种量为0.015 U/kg，蔗糖添加量为5.0%，40 ℃发酵5 h 时，制备得到的滨海白首乌酸乳抗氧化能力较强，酸甜度和黏度适中，风味和感官良好；在4 ℃条件下贮藏的最适货架期为9 d，在此货架期内滨海白首乌酸乳仍能保持较好的感官、较高的抗氧化能力和乳酸菌活菌数。虽然研究发现滨海白首乌发酵对酸乳抗氧化能力具有一定的提升作用，但具体的作用机制并不明确。因此，将在后续的研究中利用代谢组学等方法进一步探究其作用机制，进而为功能性酸乳的开发提供理论支撑。