钟嘉伟,潘 剑,2,郭雨晨,2

颌骨作为颅颌面的基本硬组织框架,是口颌系统功能及外形的基础。但是,全球有超过35亿人受到口颌系统疾病的影响。其中,发育畸形、牙周病、外伤、癌症等疾病均导致颅颌面骨的损伤[1]。目前,上述病损的修复仅局限于手术及假体的修复,缺乏有效的生物学重建手段[2]。研究颌骨的稳态以及损伤修复机制是寻找新治疗靶点的突破口。

骨骼是一个动态变化的系统,在整个生命过程中不断重塑[3]。机体通过复杂的机制对这一过程进行精密调控,其中免疫系统在骨稳态和损伤修复中起着关键的作用。2000年,Arron和Choi首次提出骨免疫学的概念,强调骨骼和免疫系统之间的双向动态作用关系[4]。随着研究深入,骨和免疫系统的相互作用逐步明确。骨免疫是指骨代谢过程受到免疫反应的调节;同时,骨细胞对免疫系统也有着调节作用。这样的一个双向调控作用称为骨免疫。

免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫活性物组成。其中对骨稳态和修复发挥调控作用的主要是免疫细胞。免疫细胞系来源于多能干细胞,其中造血多能干细胞产生两种前体细胞,一种是淋巴样前体细胞,另一种是髓系前体细胞。淋巴样前体细胞主要分化为T细胞(T-lymphocyte)、B细胞(B-lymphocyte)、自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)和树突状细胞;而髓系前体细胞主要分化为红母细胞、巨核细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和粒-单核干细胞,其中粒-单核干细胞可进一步分化为中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞。T细胞、B细胞等数种免疫细胞对骨稳态的作用已有较多研究,但是,上述免疫细胞对颌骨稳态和损伤修复的调控作用及机制还尚处于研究起始阶段。本文系统性回顾免疫细胞对骨稳态的作用机制,并结合目前骨免疫在颌骨稳态中的研究进展,旨在为后续的研究提供思路。

1 T细胞对颌骨稳态的作用

T细胞是细胞免疫的主导细胞,由淋巴样前体细胞分化而来。前体T细胞迁移到胸腺内,在胸腺内分化为成熟的具有免疫活性的T细胞。根据功能和表面标志不同,T细胞可分为辅助性T细胞(helper T cell,Th)、细胞毒性T细胞(cytotoxic T cells,Tc)、调节T细胞(regulatory T cell,Treg)和记忆T细胞。

1.1 Th细胞

Th细胞可以通过RANK/RANKL/OPG 信号轴对骨细胞发挥调控作用。早在上世纪90年代,Yoshida课题组和Wiktor-Jedrzejczak课题组就报道了3号染色体上Csfm基因隐性突变的小鼠因缺乏巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)导致体内缺少成熟的巨噬细胞和破骨细胞,其骨改建速率显著降低,表现出骨硬化症[5-6]。RANK(receptor activator of nuclear factor κB)是位于破骨细胞表面的受体。RANKL(RANK ligand)作为RANK配体,在M-CSF的协调作用下与RANK结合,促使前体细胞分化为破骨细胞[7]。后来的研究表明RANKL作用于破骨前体细胞,可激活Src蛋白,从而激活其下游的Akt及mTOR蛋白分子,促使破骨细胞分化[8]。骨保护素(osteoprotegerin,OPG)配体是一种调节破骨细胞分化和活化的细胞因子,能与RANKL结合以降低RANK结合率,从而抑制破骨细胞分化,降低骨吸收速率[7]。这些研究表明破骨细胞是在M-CSF存在下由RANKL刺激的骨髓单核细胞/巨噬细胞谱系细胞分化而来的。

Th细胞也通过其他途径调控骨稳态。Weitzmann等发现,CD4+和CD8+T细胞的免疫重建会引起小鼠骨小梁丢失[9]。与健康人群相比,类风湿性关节炎的病例中衰老的CD4+CD28-T淋巴细胞分泌大量RANKL,展现出更强的破骨诱导和促进骨吸收能力[10]。对于成骨细胞,Deng等发现CD4+T淋巴细胞分泌的γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)等细胞因子可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,而其分泌的转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)活性与成骨细胞分化呈负相关[11]。

Th细胞包括Th1、Th2、Th17细胞等几类亚型。Th1分泌的白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-1(interleukin-1,IL-1)在炎性骨吸收中起着关键作用[12]。这些炎性细胞因子可以通过刺激RANK,上调RANKL的表达,或抑制OPG的表达来促进破骨细胞生成和骨吸收[13]。其中IFN-γ可以通过抑制RANKL 信号通路直接抑制破骨细胞的生成[14]。此外,IFN-γ 在炎症或 T 细胞过度激活的状态下能通过 RANKL 非依赖性通路促进破骨细胞的生成[15]。最新研究表明,这种抑制作用是通过诱导转录合成短型色氨酸-tRNA合成酶(mini tryptophanyl-tRNA synthetase,mini-TrpRS)继而刺激单核细胞的多核化实现的[16]。Th2细胞可以通过产生IL-4和IL-13作用于破骨前体细胞,从而抑制破骨细胞的生成[17-18]。Th17细胞能产生白介素-17(interleukin-17,IL-17)。IL-17不仅能通过上调破骨前体细胞上的RANK受体来促进破骨细胞的生成,还能促进TNF-α、IL-6和IL-1等破骨细胞因子的表达[19-20]。IL-17还与骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)有很强的协同作用,两者结合后能诱导间充质干细胞向成骨细胞分化[21-22]。

1.2 Tc细胞

Tc细胞也通过多个途径调节骨稳态。Tc细胞产生的多种细胞因子,例如IL-12、IL-1、IL-6、IL-17、IL-18和TNF-α[23],参与调节RANK信号传导[24],并激活NFATc1(nuclear factor of activated T-cells,cytoplasmic 1)[25],从而促进破骨细胞分化。此外,T细胞还可以通过CD40抑制B细胞OPG的表达,从而增加破骨细胞的生成[26],导致全身及局部骨丢失[27]。

研究表明对小鼠进行细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(systemic administration of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA-4-Ig)的全身给药可抑制小鼠实验性牙周炎模型中的骨吸收,这可能是通过抑制破骨细胞的分化和活化而发挥作用的[28],它可以以CD80/CD86依赖的方式诱导破骨细胞前体细胞凋亡直接抑制破骨细胞分化[29]。

1.3 Treg细胞

Treg细胞也在骨的稳态中起着调控作用。Tregs是以Foxp3表达为特征的CD4+CD25+T细胞亚群[30]。研究表明Treg通过分泌TGF-β,IL-10,IL-5和IL-4抑制外周单核细胞的破骨分化[31-32]。此外,Treg细胞可以通过与细胞毒性T细胞相互作用影响骨的稳态和修复。Treg细胞与CD8+T细胞相互作用,能上调成骨因子Wnt10b的表达,促进骨生成[33]。Treg细胞还能抑制CD4+T细胞分泌IFN-γ和TNF-α,促进骨再生[34]。在丝线结扎诱导的小鼠牙周炎模型中,局部诱导增加Treg细胞可以减少炎症性的骨丧失[35]。研究发现与没有新骨形成的强直性脊柱炎患者相比,有新骨形成的强直性脊柱炎患者的Th17/Treg比值显著降低,而IL-10的mRNA表达与Th17/Treg的比值呈显著正相关,提示Treg可通过分泌IL-10抑制Th17,在强直性脊柱炎病例中促进新骨形成[36]。Treg细胞在腭快速扩张早期阶段通过抑制Th1和Th17细胞的功能进而抑制破骨细胞生成[37]。而在实验性牙周炎期间,Treg细胞因表型不稳定失去抗破骨细胞生成的特性,促进了Th17主导的骨丧失[38]。在自身免疫性关节炎和实验性牙周炎的小鼠模型中,Foxp3+Treg细胞亚群还被发现可以转化为自身反应性Foxp3-TH17细胞发挥作用[38-39]。

2 B细胞对颌骨稳态的作用

B细胞在生理状态下通过分泌骨保护素抑制破骨细胞的生成,而在病理状态下能激活NF-κB配体受体激活因子继而通过RANK/RANKL轴而刺激破骨细胞的生成[40]。B细胞表达CCL3和TNF等成骨细胞抑制因子,直接抑制间充质干细胞向成骨细胞分化[41]。在牙周炎动物模型中,牙周炎组局部记忆B细胞表达的RANKL显著升高,且上述细胞可在体外以RANKL依赖性方式支持破骨细胞分化[42]。促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是促进红细胞生成的关键因子,其受体(EPO-Rs)也在髓系细胞、骨细胞和免疫细胞等非红系细胞中表达。EPO能诱导小鼠前体B细胞CD115表达并促进破骨发生,而特异性敲除小鼠B细胞中的EPO-R使小鼠骨量增加。这表明B细胞产生的促红细胞生成素可能上调破骨信号[43]。

3 单核/巨噬细胞对颌骨稳态的作用

单核细胞系是一类髓系细胞群,是破骨细胞和巨噬细胞的共同来源。巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)刺激单核细胞分化为巨噬细胞,后者激活后根据功能和表面标志物不同,可以分为M1和M2两种亚型。而RANKL则促使单核细胞向破骨细胞分化[44]。

在特定的免疫微环境中,巨噬细胞可以转分化为破骨细胞。巨噬细胞经M-CSF、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和IL-4、IL-13刺激后,可形成类似破骨细胞的多核巨细胞[45-47]。M2巨噬细胞在RANKL的刺激下可以形成破骨细胞[48]。

巨噬细胞也能分泌IL-1、IL-6、IL-18、IL-23、IL-27和TNF-α等细胞因子[49],影响RANK/RANKL/OPG 破骨细胞调控轴,调控破骨细胞的分化。其中,TNF-α、IL-1β和IL-6可促进破骨细胞的分化和活化[50]。IL-18可能调节Th1细胞分化和IFN-γ的生成,是破骨生成的抑制因子[51-53]。研究还表明IL-18在体外通过c-MYC途径激活SLC7A5以增强人骨髓间充质干细胞的成骨分化[54]。IL-23能激活破骨细胞[17]。IL-6在与破骨前体细胞结合后会促进破骨生成[55]。这些细胞因子也可以影响其他细胞的功能,如IL-27可抑制Th17细胞和CD4+T细胞RANKL的表达,减少破骨细胞生成[56-57]。

巨噬细胞与成骨细胞间存在调控关系。骨组织中存在常驻巨噬细胞,即骨巨噬细胞。骨巨噬细胞在组织学上位于成骨细胞附近,与成骨细胞相互作用[58-59]。研究表明,骨巨噬细胞和炎性巨噬细胞能影响膜内成骨细胞的合成功能,其中骨巨噬细胞起到主导作用。此外,巨噬细胞在软骨内成骨过程中是必需细胞[60]。研究证实,在骨折修复的过程中,巨噬细胞与早期的修复密切相关[61-62]。

与野生型小鼠相比,巨噬细胞缺陷型小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化潜能显著下降[63-64]。后续研究证实,巨噬细胞分泌的IL-17和IL-23可以促进骨髓间充质细胞成骨分化[65]。同时巨噬细胞分泌的IL-27能通过增加早期生长反应因子2(early growth response-2,Egr-2)的表达而抑制成骨细胞凋亡,还能以Egr-2 依赖的方式上调Id2,进一步抑制破骨细胞生成[66]。另外,研究人员通过对比年轻小鼠和老龄小鼠巨噬细胞分泌性蛋白的差异,发现低密度脂蛋白受体相关蛋白1(low-density lipoprotein receptor-related protein 1,LRP 1)是导致两者骨损伤修复差异的关键,阻断LRP1导致小鼠骨折修复能力消失,而利用重组LRP1治疗老年小鼠能促进骨折愈合[67]。

巨噬细胞还可以通过分泌OSM调节骨的稳态。制瘤素 M(oncostatin M,OSM)是IL-6家族细胞因子之一,可抑制人骨髓间充质干细胞的成脂分化并刺激其成骨分化[68]。后续研究证明OSM通过JAK3/STAT3信号通路促进牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)的成骨分化和成骨相关基因的表达,阻断STAT3信号通路能抑制DPSCs成骨分化,并导致基质矿化受到显著影响[69]。巨噬细胞可通过OSM-STAT3/YAP1 信号轴调节成骨[70],在大鼠的腰椎退行性疾病模型中,使用抗OSM中和抗体阻断OSM可预防骨硬化。

4 中性粒细胞和肥大细胞对颌骨稳态的作用

中性粒细胞来源于骨髓,具有吞噬、杀菌和趋化作用。在骨组织炎性反应过程中,中性粒细胞最先到达病灶,并通过其趋化作用募集大量先天性和适应性免疫细胞及骨髓间充质干细胞,在IL-8的诱导作用下,启动软骨内成骨的过程。在此过程中,N2极化的中性粒细胞介导巨噬细胞和CD4+T细胞向抗炎型转化;还可以分泌SDF-1α进一步通过SDF-1/CXCR4通路及其下游PI3K/Akt通路促进骨髓间充质干细胞趋化[71]。

粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)是粒细胞增殖、分化和存活的关键调节因子。最近的研究表明,G-CSF对实验动物和患者的骨骼健康都有不利的影响。与对照组相比,用G-CSF处理后,小鼠的成骨细胞和骨细胞数量明显减少,而且成骨相关标志物表达量也下降。机制研究显示这一作用是通过诱导细胞凋亡完成的。对小鼠使用一氧化氮抑制剂可以部分恢复G-CSF刺激后成骨细胞的数量和成骨相关指标。据此,G-CSF可通过上调中性粒细胞中一氧化氮的产生来抑制小鼠的成骨细胞和骨细胞的生长[72]。在大鼠和小鼠的衰老骨骼中,炎性细胞和衰老的免疫细胞,包括中性粒细胞和巨噬细胞会聚集在骨髓中,分泌大量的甘卡霉素,导致成骨和破骨的失衡。而具有甘卡霉素基因缺失的中性粒细胞和巨噬细胞的小鼠会表现出骨骼老化延迟[73]。

肥大细胞来源于髓样细胞,参与免疫调节,具有弱吞噬功能,也对骨稳态有着调控作用。肥大细胞能通过细胞表面RANKL诱导破骨细胞生成[74],还能通过分泌组胺、TNF和IL-6等促进破骨细胞的生成或通过分泌IL-1抑制成骨细胞活性来发挥骨吸收的作用[74-75]。研究人员通过研究组胺对小鼠骨髓细胞的影响,发现肥大细胞分泌的组胺能通过H1受体诱导破骨细胞的生成[76]。在小鼠的颅骨缺损模型中,肥大细胞展现出了促进成骨的作用[77]。对于成骨细胞,肥大细胞介导肌动蛋白细胞骨架的重排改变成骨细胞形态;并且可以下调细胞成骨分化相关mRNA的表达而抑制成骨细胞的功能[78]。最近发现,肥大细胞分泌的糜酶被人原代成骨细胞摄取后,通过TGF-β相关信号通路影响成骨相关因子的表达,并影响成骨细胞胞外基质的合成及分泌,从而抑制成骨细胞功能[79]。

目前,国内学者用单细胞RNA测序构建了小鼠下颌骨的单细胞图谱。数据分析表明,与长骨相比,小鼠牙槽骨中发现了更加活跃的免疫微环境。其中牙槽骨单核细胞/巨噬细胞表达更高水平的OSM,从而促进未分化间充质细胞的成骨分化[80]。作为国内首个小鼠颌骨免疫微环境的单细胞测序研究,该研究提示免疫细胞在颌骨可能发挥更加重要的调控作用。后续研究可以通过挖掘相应数据,探究更多的作用细胞和效应细胞,并发掘更多的作用通路,为疾病治疗的药物研发开创新的切入靶点。同时,进行大动物以及人类样本的深入研究,将进一步推进骨免疫研究数据向药物研发和临床应用的转化。

综上,免疫系统对于颅颌面的骨具有关键的调控作用。但是,目前的研究数据尚无法构建颌骨免疫稳态调节的完善的分子调控网络机制。结合近年来单细胞组学技术、空间转录组技术等新一代研究技术的广泛应用,有望发现更多的调控分子靶点,从而构建更为完善的分子调控网络学说,同时为相关疾病治疗药物的研发提供更新的治疗靶点和更加完善的理论基础。