舒 展，王琤帅，应斌斌，金 芩，陈 旦

（浙江省金华市食品药品检验检测研究院，浙江 金华 321000）

中成药中常非法添加化学药物，以磷酸二酯酶Ⅴ型抑制剂（PDE5i）为例，由于功能特殊，利润巨大，作为非法添加物的现象尤为严重［1-3］。目前，补充检验方法BJS201805规定了90种那非类的物质的检验方法［4］，但在日常检验工作中发现此标准规定范围外的、通过结构修饰得到的新型PDE5i［5-9］。非法添加物二乙氨基前他达拉非是一种他达拉非的结构衍生物［10-11］，尚缺乏高分辨质谱的定性定量研究。为此，本研究中采用高效液相色谱-高分辨四极杆-飞行时间-质谱（HPLCQ-TOF-MS）法对中成药中的二乙氨基前他达拉非进行分析方法的研究，同时利用高分辨质谱对裂解规律进行总结，可用于他达拉非系列衍生物的非目标化合物的筛查。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 6530 型HPLC - QTOF 液质联用仪（美国Agilent 公司），配有Mass Hunter B04.00 软件；XS205DU型电子天平（瑞士Mettler 公司，精度为0.01 mg）；KQ-250DE 型超声仪（昆山市超声仪器有限公司，功率为250 W，频率为40 kHz）；Direct - Q 5UV 型超纯水系统（美国Millipore公司）。

1.2 试药

二乙氨基前他达拉非对照品（批号520043 -201401，含量99.7%），他达拉非对照品（批号510170 -202102，含量99.8%），氨基他达拉非对照品（批号520042 - 202002，含量99.5%），均购于中国食品药品检定研究院；N-去甲基他达拉非对照品（多伦多研究化学公司，批号19-MVI-126-1，含量99.8%）；乙腈（色谱纯，美国霍尼韦尔公司，批号EC943 - CN）；冰醋酸（色谱纯，德国Merck 公司，批号Z0763908147）；样品均为抽检样品（批号分别为A363632，20210509，ST11220，BN00701，20210315）。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Agilent EC - C18柱（100 mm × 3.0 mm，2.7 µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%乙酸溶液（B），梯度洗 脱（0～15 min 时10%A～40%A，15～20 min 时40%A～90%A，20～30 min 时90%A，30～31 min 时10%A，31～40 min时10%A）；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：1µL。

2.1.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子模式；质荷比（m/z）扫描范围：50～1 000；雾化气（N2）压力：35 psi；干燥气（N2）流速：12L/min；温度：350℃；毛细管电压：3.5kV；碎裂电压：180 V；二级质谱碰撞裂解能量：30 eV。

2.2 溶液制备

对照品贮备液：取二乙胺基前他达拉非对照品10.52 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加50%乙腈适量，超声使溶解并定容，摇匀，即得。

混合对照品溶液：取二乙氨基他达拉非10.12 mg，氨基他达拉非10.03 mg，N-去甲基他达拉非10.22 mg，他达拉非10.11 mg，精密称定，置10 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容，摇匀，用50%乙腈稀释，得质量浓度为1 mg/mL的溶液，即得。

供试品溶液：取样品1.0 g，置100 mL 容量瓶中，用50%乙腈超声溶解并定容，精密量取5 mL，置50 mL 容量瓶中，用50%乙腈定容，即得。

2.3 质谱行为分析

取2.2项下对照品贮备液，用50%乙腈稀释成质量浓度为1.05µg/mL 的对照品溶液，按2.1 项下色谱与质谱条件进样测定。由于二乙氨基前他达拉非结构中存在N，易与H+结合形成［M + H］+准分子离子，与加钠分子离子峰［M + Na］+比较，［M + H］+的丰度更高（图1）。故在实际样品测定中，选择［M+H］+为母离子进行定量分析。

图1 二乙氨基前他达拉非一级质谱图Fig.1 The first order mass spectrum of diethylaminopretadalafil

2.4 定量分析

采用Agilent Mass Hunter B04.00 软件按精确相对分子质量464.218 0 提取离子色谱图进行定量分析。提取质量窗口为10×10-6。

2.5 二乙氨基前他达拉非裂解规律推测

通过二乙氨基前他达拉非的二级质谱图（图2）推测可能的裂解途径（图3）。裂解途径1：哌啶环上的C—N键发生断裂形成m/z为334.107 4 的碎片离子，进一步脱去甲氧酰基形成m/z为274.086 3 的碎片离子。裂解途径2：通过反Diels-Alder 反应得到m/z为262.086 3的碎片离子，此碎片离子最终形成m/z为135.044 1 的碎片离子［12］。

图2 二乙氨基前他达拉非二级质谱图Fig.2 The second order mass spectrum of diethylaminopretadalafil

图3 二乙氨基前甲基他达拉非的裂解途径及主要碎片离子Fig.3 Pyrolysis pathway and main fragmentation of diethylamino⁃pretadalafil

2.6 二乙氨基前他达拉非方法学考察

线性关系考察与检测限、定量限确定：取2.2 项下对照品贮备液，用50%乙腈稀释成质量浓度分别为0.11，0.53，1.05，2.10，5.26 µg/ mL 的系列对照品溶液，按2.1 项下色谱与质谱条件进样测定，以母离子峰面积（Y）对二乙氨基前他达拉非质量浓度（X）进行线性回归，得回归方程Y= 13 816 134X+ 4 257 269（r=0.997 0，n=5）。结果表明，二乙氨基前他达拉非质量浓度在0.11～5.26 µg/ mL 范围内与峰面积线性关系良好。取对照品贮备液，用50%乙腈稀释后，按2.1项下色谱与质谱条进样测定，以信噪比（S/N）分别为3∶1和10∶1的质量浓度为检测限和定量限。结果检测限为0.021µg/mL，定量限为0.053µg/mL。

精密度试验：取线性关系考察项下对照品溶液（质量浓度为1.05 µg/mL）适量，按2.1 项下色谱、质谱条件连续进样测定5 次，以峰面积计算精密度。结果的RSD为3.52%（n=5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取线性关系考察项下对照品溶液（质量浓度为1.05 µg/ mL）适量，分别于0，2，4，8，12 h 时按2.1项下色谱与质谱条件进样测定母离子峰面积。结果的RSD为4.56%（n= 5），表明对照品溶液在12 h 内稳定性良好。

重复性试验：取样品（批号为A363632），依法平行制备供试品溶液6 份，按2.1 项下色谱与质谱条件进样测定，记录母离子峰面积。结果的RSD为2.33%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取未检出二乙氨基前他达拉非的阴性片剂粉末1 g，精密称定，置100 mL 容量瓶中，分别精密加入对照品溶液（质量浓度为105.2µg/mL）0.8，1.0，1.2 mL，用50%乙腈定容，每个浓度平行制备3份，按2.1 项下色谱与质谱条件进样测定，计算加样回收率。结果见表1。

表1 二乙氨基前他达拉非加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test of diethylaminopretadalafil（n=9）

2.7 样品含量测定

取样品（批号为A363632），依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱与质谱条件进样测定，得到与对照品保留时间相同的提取离子流色谱峰（图4），其准分子离子峰［M +H］+m/z为464.217 6（理论m/z为464.218 0，Δm= -0.8×10-6），与二级质谱图一致（图5）。结果测定含量为3.58 mg/g。

图4 供试品溶液提取离子色谱图Fig.4 Extraction ion chromatogram of the test solution

图5 供试品溶液与对照品溶液二级质谱图Fig.5 The second order mass spectrum of the test solution and the reference solution

2.8 他达拉非类化合物裂解规律比较

通过比较他达拉非、氨基他达拉非和N-去甲基他达拉非的裂解规律［13-14］发现，他达拉非类化合物均具有m/z为135.044 1 的特征碎片离子（图6），其原因为此类物质具有胡椒环结构［15］。实际工作中，可根据这一特征离子快速筛查他达拉非类化合物，再根据裂解规律推测化合物的结构，在结构信息未知的情况下实现物质结构的推测。

A.二乙氨基前他达拉非 B.氨基他达拉非 C.N - 去甲基他达拉非 D.他达拉非图6 他达拉非类化合物二级质谱图1.Diethylaminopretadalafil 2.Animotadalafil 3.Nortadalafil 4.TadalafilFig.6 The second order mass spectrum of tadalafil derivatives

2.9 基于特征离子的他达拉非类化合物筛查

取2.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱与质谱条件，以auto MS/ MS 模式进行扫描，采用Mass Hunter 软件，按精确相对分子质量135.044 1 处二级质谱提取离子色谱图（图7），快速识别他达拉非类化合物，根据裂解规律推测出二乙氨基前他达拉非、他达拉非、氨基他达拉非、N-去甲基他达拉非等。

1.二乙氨基前他达拉非 2.氨基他达拉非 3.N - 去甲基他达拉非 4.他达拉非图7 混合对照品溶液在m/z为135.044 1处的二级质谱提取离子色谱图1.Diethylaminopretadalafil 2.Animotadalafil 3.Nortadalafil 4.TadalafilFig.7 Extraction ion chromatogram of mixed reference solution at m/z of 135.044 1

3 讨论

3.1 流动相选择

曾考察水-乙腈、10 mmol/L 乙酸铵溶液-乙腈、0.1%乙酸溶液- 乙腈流动相体系对分离效果及质谱灵敏度的影响。结果采用0.1%乙酸溶液-乙腈流动相体系不仅具有较好的峰形，且具有较高的质谱响应。故选择0.1%乙酸溶液-乙腈作为流动相。

3.2 毛细管出口电压优化

随着毛细管出口电压的增加，二乙氨基前他达拉非的［M + H］+离子响应逐渐增加，但随后发生源内裂解，离子响应逐渐减小。采用100～200 V 的毛细管出口电压测定（每隔10 V增加1次），结果毛细管出口电压设定为160 V时［M+H］+离子具有最高响应值。

3.3 碰撞裂解能优化

他达拉非类化合物在碰撞裂解的条件下易产生碎片离子。采用10，20，30，40 eV 的碰撞裂解能对二乙氨基前他达拉非进行裂解。结果碰撞裂解能为30 eV 时裂解碎片细节最丰富，有利于裂解途径的归纳和鉴别测定。故碰撞裂解能设定为30 eV。

3.4 方法评价

二乙氨基前他达拉非作为一种新型的PDE5i，目前报道的检测方法较少。本研究中采用HPLC 作为分离手段，以Q - TOF - MS 检测器作为检测手段，定性可靠。特别是通过对他达拉非类化合物裂解规律的总结，利用药物构效关系设计的原理，发现此类物质特征碎片离子。利用特征碎片离子能有效发现他达拉非类化合物，为非法添加物的检测提供了新思路，从靶向目标化合物的筛查转向了非靶向、非目标化合物的筛查，为市场监管提供技术支撑，保障患者用药的安全。