詹树煜，黄 薇，陈文良

（广东省中医院，广东 广州 510120）

丹参酮ⅡA 是从中药丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）中提取出的一种重要的脂溶性单体[1]。研究表明，丹参酮ⅡA 具有良好的抑制肿瘤的药理作用，其主要是通过抑制血管生成来抑制肿瘤[2]。在中医临床上，丹参是一味常用于治疗肾脏疾病的中药，亦有研究显示其具有抑制肾脏炎症的作用[3]。肾皮质近曲小管是肾皮质中占比最多的细胞[4]。当致炎因素刺激肾脏时，肾皮质近曲小管会出现凋亡，释放促炎因子，参与肾脏的炎症病理改变[5]。然而丹参酮ⅡA 对肾皮质近曲小管细胞活力和炎症的作用目前尚待进一步阐明。本研究旨在探究丹参酮ⅡA 对体外人肾皮质近曲小管的影响作用。

1 研究方法

1.1 主要材料

丹参酮ⅡA 购自成都瑞芬思（纯度≥98%）；脂多糖购自Sigma 公司（CAT#L2630）；CCK8 试剂盒购自大连美仑（CAT#MA0218、MA0186）；DMEM/F12 基础培养基、细胞培养用青霉素/ 链霉素和0.25%含EDTA 胰酶购自Gibco 公司（CAT#C11330500BT、10378016、25200072）；胎 牛 血 清 购 自BI 公 司（CAT#04-001-1ACS）。RNA 提取试剂、反转录试剂 盒、SYBR 染 料 购 自AG 公 司（CAT# AG21102、AG11728、AG11718）。

1.2 人肾皮质近曲小管细胞系（HK-2）的培养与干预

HK-2 细胞系购自武汉普诺赛生命科技有限公司（CL-0109）。细胞用完全培养基（DMEM/F12+10%胎牛血清+1% 青霉素/ 链霉素）在5% CO2、37℃的培养箱中培养。当细胞汇合度约为90%时，应用0.25%胰蛋白酶以1:3 的比例进行传代培养。

1.3 CCK8 实验

将细胞以5×103颗/ 孔的密度均匀播种在96 孔板中，每孔加100 µL 的完全培养液，置入培养箱中培 养24 h。次 日 给 予0、1、2、4、8、16、32、64、128 µg/mL 的脂多糖或0、2.5、5、10、20、40、80 µM的丹参酮ⅡA（溶于DMSO）干预22 h。每孔加10 µL的CCK8 溶液混匀，继续避光孵育2 h。在全波长酶标 仪（Thermo Fisher Scientific, Multiskan GO 1510）中检测450 nm 波长处的吸光度。

1.4 细胞总RNA 提取

将细胞以1.5×105颗/ 孔的密度均匀播种在96孔板中，每孔加2 mL 的完全培养液，置入培养箱中培养24 h。次日给予空白对照组、脂多糖组（4 µg/mL）、丹参酮ⅡA 低剂量组（4 µg/mL 脂多糖+20 µM 丹参酮ⅡA）、丹参酮ⅡA 高剂量组（4 µg/mL 脂多糖+40 µM丹参酮ⅡA）对应干预。24 h 后以PBS 润洗3 次，加入500 µL/ 孔的RNA 提取试剂，并遵照试剂盒说明书进行总RNA、合成cDNA 的提取。

1.5 实时荧光定量PCR 实验（qPCR）

委托上海生工公司合成TNF-α（正义链：5’-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG，反 义 链：5’-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG）、IL-1β（正义 链：5’-ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA，反义链：5’-GTCGGAGATTCGTAGCTGGA）和β-actin（正义链：5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT，反义链：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC）。按照SYBR 染料试剂盒说明书配置试剂，并加入1 µL 浓度为1 µg/µL的cDNA，最后按说明书设定运行程序进行实时荧光定量分析（ABI, QuantStudio ™ 5）。

1.6 统计学检验

运用SPSS 26.0 统计软件进行统计检验，所有数据均以±s表示。两组间比较进行t检验，当P＜0.05时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的脂多糖及丹参酮ⅡA 对HK-2 细胞活力的影响

本研究通过给予不同浓度的脂多糖干预来观察脂多糖对肾小管上皮细胞形态及活力的影响。结果显示，随着脂多糖干预浓度梯度的上升，HK-2 的细胞存活率逐步上升，并在4 µg/mL 浓度时达到最高的增殖率（见图1A）。梯度给予不同浓度的丹参酮ⅡA 后，与空白对照组相比，大于10 µM 浓度的丹参酮ⅡA 组出现明显的细胞抑制（见图1B）。结果表明，脂多糖会导致HK-2 异常增殖，而丹参酮ⅡA 具有抑制HK-2增殖的作用。

图1 不同浓度脂多糖及丹参酮ⅡA 对HK-2 的影响

2.2 丹参酮ⅡA 对脂多糖诱导HK-2 细胞活力的影响

为探索丹参酮ⅡA 对脂多糖诱导的HK-2 细胞活力的影响，我们进一步检测了脂多糖联合丹参酮ⅡA干预后HK-2 细胞活力及形态上的改变。结果显示，与脂多糖干预组相比，给予20、40、80 µM 丹参酮ⅡA 时细胞异常增殖率出现明显下降（见图2A）。形态学观察显示，空白对照组细胞透光均匀，细胞密度约60%，细胞呈饱满圆形。脂多糖组的细胞形态变为不规则状，透明度不均一，细胞密度达到90%以上（见图2B）。相较于脂多糖组，给予丹参酮ⅡA（40 µM）后，细胞的密度有一定程度的下降，细胞的透光度有一定的改善。结果表明，10 µM ～80 µM 的丹参酮ⅡA 能改善脂多糖诱导的HK-2 细胞异常增殖及形态异常。

图2 丹参酮ⅡA 对脂多糖诱导HK-2 炎症模型细胞活力及形态的影响

2.3 丹参酮ⅡA 对脂多糖诱导的HK-2 细胞炎症的影响

为了进一步探究丹参酮ⅡA 对HK-2 炎症的影响，本研究通过qPCR 检测了脂多糖及丹参酮ⅡA 干预后HK-2 中炎症因子TNF-α 和IL-1β 的表达（见图3A、B）。结果显示，给予脂多糖干预后，HK-2的炎症因子表达水平明显上升，表明细胞炎症损伤模型造模成功。与脂多糖组相比，给予丹参酮ⅡA 后，细胞炎症因子的表达水平明显下降，且呈剂量依赖性，表明丹参酮ⅡA 能抑制细胞模型的炎症。

图3 丹参酮ⅡA 对脂多糖诱导的HK-2 细胞炎症的影响

3 讨论

目前，丹参酮ⅡA 已有应用于临床的制剂—丹参酮ⅡA 磺酸钠注射液，其主要用于治疗心脑血管相关的疾病，例如冠心病、脑供血不足、动脉闭塞症等[6]。有研究指出，丹参酮ⅡA 是具有明确药理活性的单体，具有良好的临床疗效。肾脏是血管、血流丰富的脏器，从传统中医药或现代药理学的角度看，丹参酮ⅡA 治疗肾脏疾病都具备理论基础。本研究进一步提供了实验数据的支持。研究发现，丹参酮ⅡA 对脂多糖诱导的人肾皮质近曲小管细胞系HK-2 的炎症损伤具有抑制作用，并可保护细胞活力。目前已有文献报道了丹参酮ⅡA 对急性肾损伤、糖尿病肾病等肾脏疾病的作用机制[7-8]。这些研究表明，丹参酮ⅡA 对肾脏具有保护作用。本研究从对体外肾皮质近曲小管影响的角度进一步分析了丹参酮ⅡA 的作用，有助于揭示丹参酮ⅡA 的肾脏保护作用机制。

综上所述，本研究有助于明确丹参酮ⅡA 对肾脏保护作用的机制，可为丹参酮ⅡA 用于治疗肾脏疾病提供参考依据，从而可扩大其临床适应症范围。