卢 娜，梁栋龙，李 静，余南生

（佛山市顺德区乐从医院，广东 佛山 528315）

增生性瘢痕是一种纤维化皮肤病，增生性瘢痕组织会对皮肤的美观和功能产生严重影响，给患者造成不同程度的心理负担，影响其生活质量。为此，国内外对增生性瘢痕的研究都非常重视。传统的治疗方法包括手术、打磨、冷冻、压迫、外用药物、激素封闭等，但效果并不理想。5- 氨基酮戊酸光动力疗法（5-ALA-PDT）是近年来的一种新的治疗方式，在皮肤科的应用较为多样化，包括在肿瘤皮肤科、感染性皮肤科和皮肤美容科都有应用。该疗法优点突出，如疗效好、安全性高、患者耐受性好等，且应用范围广泛，有较好的治疗和美容效果。从增生性瘢痕中成纤维细胞的病理生理学来看，5-ALA-PDT 可用于治疗增生性瘢痕。近年来，国内有学者研究了光动力疗法在体外对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响[1]，也有学者测试了光动力疗法在动物中治疗增生性瘢痕的适用性[2]，均取得了较好的试验结果。研究发现，成纤维细胞增殖可过度产生胶原纤维，主要为Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维，而抑制这两种胶原纤维的产生可有效治疗增生性瘢痕[3]。本研究就5-ALA-PDT 对增生性瘢痕成纤维细胞转化生长因子-β1（TGF-β1）/Smads 信号通路的影响进行分析，现将研究方法和结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 基线资料

选取2020 年1 月至2022 年8 月我院收治的增生性瘢痕患者66 例作为研究对象。病例纳入标准：（1）有不同程度和类型的增生性瘢痕的临床表现：皮肤伤口愈合后疤痕扩散并突出于皮肤表面，不规则，凹凸不平，伴发红、阻塞、发硬、发热、发痒、发紧等；（2）年龄25 ～35 岁；（3）在研究开始前1 个月内停用其他药物；（4）知悉研究内容，并签署知情同意书。病例排除标准：（1）合并严重的心、肝、肾疾病；（2）治疗依从性差；（3）对5-ALA-PDT 不耐受。将患者分为对照组和研究组，各33 例。研究组中，男10 例，女23 例，平均年龄（29.68±4.78）岁。对照组中，男12 例，女21 例，平均年龄（28.67±4.57）岁。两组基线资料相比，差异无统计学意义（P＞0.05）本研究得到了医院伦理委员会的批准，并已向有关部门报告和登记。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 用5- 氨基酮戊酸（5-ALA，上海复旦张江生物医药有限公司）和BIOF 水合凝胶配制成20% 的凝胶溶液对研究组进行光动力治疗。在治疗前，将患者安置在黑暗的房间内40 min，用清水冲洗局部皮肤，然后遮阳20 min。治疗时让患者戴上护目镜，在距离皮肤15 cm 处接受波长为（633±3）mm、能量为128 J 的红光照射治疗。治疗后，用薄膜包裹患处，外用无菌纱布覆盖，4 h 后拆除敷料，嘱患者在24 h 内避免强光照射患处。给予对照组单纯激光治疗，半导体激光器的输出功率为100 mW/cm2，总能量为40 ～50 J/cm2，波长为635 nm，每次治疗30 min。两组均每5 d 治疗1 次，共治疗6 次。

1.2.2 成纤维细胞培养 切开瘢痕组织，切取皮下组织，在平衡盐水中切成0.5 cm×0.5 cm 的小块，在胶原酶溶液中切割1 h，以200 目尼龙网过滤，离心过滤细胞液，弃去上清液，加入DMEM 培养基继续培养，用第4 ～8 代细胞进行测试。

1.2.3 酶联免疫吸附试验 采用酶联免疫吸附试验测定不同浓度（0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L）ALA对成纤维细胞TGF-β1、基质金属蛋白酶1（MMP-1）分泌的影响。将胰蛋白酶消化的单层培养细胞接种在96 孔培养板的1.0×104孔中，培养48 h 后，在96 孔板中加入不同浓度（分别为0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L）的ALA，并加入无血清的DMEM 培养液，分别在灯光下照射20 min 作为对照组。将培养物在无ALA 和仅有光照的CO2培养箱中培养4 h，并加入含有10% 血清的培养基。24 h 后，采用酶联免疫吸附试验测定成纤维细胞在不同浓度ALA 下分泌的TGF-β1、MMP-1 的含量。

1.2.4 Western Blot 法 采 用Western Blot 法 检 测MAPK 信号通路中ERK、JNK 和P38 的水平，按文献[4]报道的方法进行检测。

1.3 观察指标

（1）观察研究组治疗前后成纤维细胞的状态。（2）观察不同浓度5-ALA 对成纤维细胞增殖能力的影响。通过MTT 比色法检测细胞的增殖率来确定成纤维细胞的增殖能力，A 值越低说明5-ALA 对成纤维细胞增殖的抑制作用越显著。（3）观察不同浓度5-ALA对成纤维细胞前胶原（包括Ⅰ前胶原/β-actin、Ⅲ前胶原/β-actin）mRNA 表达的影响。（4）观察5-ALA对MAPK 信号通路中ERK、JNK 和P38 的影响。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件处理各项数据，计数资料、计量资料分别用%、±s表示，分别行χ²、t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究组治疗前后成纤维细胞状态的观察

治疗前，显微镜下观察研究组的成纤维细胞：细胞间隔紧密，呈放射状，细胞核呈圆形或椭圆形，核仁不一，细胞质向两极突出，细胞核为浅蓝色，细胞质为粉红色；用5-ALA 进行光动力处理后，显微镜下观察到成纤维细胞为椭圆形或圆形，细胞间连接松散，失去正常细胞排列，在线粒体和粗面内质网中观察到了超微结构的变化。

2.2 不同浓度5-ALA 对成纤维细胞增殖能力的影响

研究组在0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L浓度的5-ALA 下，成纤维细胞增殖能力的A 值分别为（0.215±0.011）、（0.215±0.011）、（0.188±0.007）。详见表1。对照组成维细胞增殖能力的A 值为（0.244±0.011）。研究组不同浓度5-ALA 下成纤维细胞的增殖能力均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

表1 研究组不同浓度5-ALA 对成纤维细胞增殖能力的影响（n=33）

2.3 不同浓度5-ALA 对成纤维细胞前胶原mRNA表达的影响

研究组不同浓度5-ALA 对成纤维细胞前胶原（包括Ⅰ前胶原/β-actin、Ⅲ前胶原/β-actin）mRNA 表达的影响不同，且均低于对照组（P＜0.05）。详见表2。

表2 不同浓度5-ALA 对成纤维细胞前胶原mRNA 表达的影响（± s）

表2 不同浓度5-ALA 对成纤维细胞前胶原mRNA 表达的影响（± s）

注：*与对照组相比，P ＜0.05；β-actin 为β- 肌动蛋白。

指标 研究组（n=33）对照组（n=33）0.25（mmol/L）0.5（mmol/L）1.0（mmol/L）2.0（mmol/L）Ⅰ前胶原/β-actin 0.847±0.151* 0.737±0.126* 0.721±0.115* 0.694±0.051* 1.337±0.054*Ⅲ前胶原/β-actin 0.763±0.105* 0.551±0.063* 0.548±0.035* 0.527±0.015* 1.145±0.036*

2.4 不同浓度5-ALA 对成纤维细胞TGF-β1、MMP-1 分泌的影响

通过体外细胞培养，给予不同浓度5-ALA 测定发现，与对照组的TGF-β1、MMP-1（23.4±1.3）ng/L、（409.5±10.2）ng/L 相 比，研 究 组0.5 mmol/L、1.0 mmol/L 浓度的5-ALA 对TGF-β1的分泌起到抑制作用，对MMP-1 的分泌则起到诱导作用。详见表3。

表3 不同浓度5-ALA 对成纤维细胞TGF-β1、MMP-1分泌的影响（n=33，ng/L，± s）

表3 不同浓度5-ALA 对成纤维细胞TGF-β1、MMP-1分泌的影响（n=33，ng/L，± s）

指标 0.25 mmol/L 0.5 mmol/L 1.0 mmol/L TGF-β1 17.5±1.6 15.1±1.0 14.6±0.9 MMP-1 601.4±10.3 802.3±11.4 895.7±11.3

2.5 5-ALA 对MAPK 信号通路中ERK、JNK 和P38 的影响

用适当浓度的5-ALA 处理细胞，辐照1 h 后收集细胞，提取蛋白质，采用Western Blot 法测定MAPK 信号通路中ERK、JNK 和P38 的水平，结果发现，在研究组中，观察到MAPK 家族的信号在0.5 mmo/L时明显增强，与对照组相比，ERK（44 ku）、P38（38 ku）和JNK（46 ku）分别增加了113.0%、36.0% 和67.0%（P＜0.05）。

3 讨论

增生性瘢痕是一种纤维化皮肤病，其特点是成纤维细胞增殖和胶原纤维（主要的细胞外基质）的过度形成，导致胶原细胞外基质大量异常沉积，引起局部皮肤畸形和功能障碍。Smad 蛋白是TGF-β 信号通路中重要的受体后信使，TGF-β1与相应的受体结合并发挥生物效应，TβR Ⅰ、TβR Ⅱ和TβR Ⅲ具有信号传导所必需的Ser/Thr 蛋白激酶活性。具有Ser/Thr 蛋白激酶活性的跨膜信号受体对信号传导至关重要，它参与受体下游的细胞内信号传导[4]。被激活的TGF-β 受体通过蛋白分子（如Smads）调节目标基因的表达，Smads 将细胞内的信号级联到转录的细胞核。TGF-β1通过调节不同的细胞外基质成分来调节细胞外基质的形成（细胞内转录或转录后水平）和表达，并通过调节水解酶的形成和活性抑制细胞外基质的代谢。成纤维细胞分泌的TGF-β1是瘢痕形成过程中细胞外基质蛋白合成的重要刺激因子。增生性瘢痕的传统治疗方法包括手术、磨削、冷冻、压缩、局部用药和激素封闭等，但效果并不理想[5]。由于增生性瘢痕中的成纤维细胞比正常皮肤细胞有更强的积累光敏剂的能力，故可通过在非热激光和光敏剂存在的情况下对其进行照射来达到治疗的目的。光敏剂吸收光能并进入激发状态，在此状态下光敏剂将能量传回给氧气，产生活性氧和自由基，对瘢痕组织成纤维细胞的生物膜造成氧化损伤，最终导致细胞凋亡和坏死。5-ALA 作为第二代光敏剂，很容易被瘢痕组织中的成纤维细胞吸收，并由ALA 脱水酶和一系列的酶转化为强效的光敏剂，如原卟啉IX（PpIX），在特定光的照射下它通过产生活性氧和自由基来伤害目标细胞。研究发现，ALA 的浓度影响瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和胶原蛋白Ⅲ的表达，其抑制作用随着浓度和光照时间的增加而增加[6]。本研究结果也表明，增生瘢痕组织中的成纤维细胞在采用5-ALA 进行光动力治疗后形态发生了显著改变：体外培养的成纤维细胞呈正常的贝壳状，壁附着良好，细胞核大，细胞质完整，边界清晰；5-ALA 浓度超过一定界值时，细胞形态的折叠随着浓度的增加而增加。另一方面，随着5-ALA浓度的增加，成纤维细胞细胞膜和细胞壁的破裂增加，细胞质过度充盈，细胞核减少或碎裂，出现不同大小的细胞质颗粒。5-ALA-PDT 治疗增生性瘢痕的原理主要是：活跃增殖的目标细胞比周围的正常细胞具有更大的积累光敏剂的能力，通过使用特定波长的光在合适的时间照射目标细胞，能诱发一系列的生化反应，破坏活跃增殖细胞的生物膜，进而达到灭活的目的[7]。研究显示，5-ALA-PDT 对增殖性瘢痕成纤维细胞和成纤维细胞前胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的基因表达在不同浓度下存在差异性，且对第4 ～第8 代原代培养的成纤维细胞的TGF-β1/Smads 信号通路确实存在影响[8]。

本 研 究 发 现，0.5 mmol/L、1.0 mmol/L 浓 度的5-ALA 对TGF-β1的分泌起到了抑制作用，对MMP-1 的分泌起到了诱导作用。可能的原因是：MMP-1 是一种正常存在于人体内的蛋白酶，其生理功能是降解胶原Ⅳ，早期MMP-1 的分泌增加促进了胶原Ⅳ的重塑；TGF-β1能促进胶原蛋白的合成，改善皮肤老化；光敏剂能明显增加细胞的光吸收性，增强细胞的应激反应，诱导细胞凋亡，从而抑制TGF-β1的分泌。但人体内是否存在一种机制来对抗MMP-1 的异常增加或激活补偿途径需要进一步研究。本研究中，在研究组中观察到MAPK 家族的信号在0.5 mmo/L 时明显增强，与对照组相比，ERK（44 ku）、P38（38 ku）和JNK（46 ku）分别增加了113.0%、36.0% 和67.0%（P＜0.05）。主要原因是：一方面，一定量的5-ALA 可能诱导细胞凋亡或细胞死亡，这种作用可能抵消ERK 的增殖作用，或为补偿性激活；另一方面，5-ALA 影响其他两个与应激有关的MAPK 激酶，即JNK 和P38，它们相互作用，共同决定细胞的反应。相关报道指出，ALA 可能通过刺激P38 和激活JNK 来抑制成纤维细胞的增殖[9]。本研究中，5-ALA-PDT 对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的抑制作用是在MTT 试验中检测到的，在0.25 ～2.0 mmol/L的浓度范围内，抑制作用随着5-ALA 浓度的增加而增加，在5-ALA 浓度为0.5 mmol/L 时达到高峰[10-11]。

综上所述，采用5-ALA-PDT 治疗增生性瘢痕可取得一定的成效。5-ALA-PDT 可通过抑制Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白基因的合成来抑制增生性瘢痕中成纤维细胞的增殖，并对TGF-β1起到抑制作用，对MMP-1 起到诱导作用，同时观察到MAPK 信号通路在浓度为0.5 mmo/L 的5-ALA 下增强，该浓度可作为5-ALA-PDT 治疗增生性瘢痕的参考浓度。