张 倩，王慧琴，吴卫东*

（1.石河子大学，新疆 石河子 832000；2.新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科，新疆 乌鲁木齐 830001）

银屑病（psoriasis）是一种免疫介导的遗传病[1]。了解银屑病患者的免疫功能以及固有免疫与适应性免疫之间的相互作用有助于控制这种复杂的疾病。目前，研究者们开始致力于分析银屑病的基因表达。微阵列或RNA-seq 数据的差异表达分析显示，大量的编码和非编码基因在银屑病皮肤和健康对照皮肤之间存在差异表达[2]。一项基于RNA-Seq 的基因表达研究从银屑病皮损和正常皮肤的大量样本中发现了许多免疫系统中的差异表达基因[3]。基于RNA-Seq 数据的分析可以研究银屑病中的选择性剪接事件的变化。本研究将从RNA-Seq 技术角度探究是否存在相关RNA 结合蛋白，旨在寻找未发现的与银屑病发病机制相关的靶基因。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究样本 银屑病病变组样本取5 例，正常对照组样本取5 例，针对每个样本的比对结果用StringTie软件进行概率模型重建样本中的转录本合并各个重建的样本转录本进行汇总，进而生成一个可代表本项目样本转录情况的转录本集合。

1.1.2 试剂和仪器 DMEM 培养基，PBS 缓冲液(Thermo Fisher)，胰酶（Thermo Fisher)，1.5% 琼脂糖凝胶，NanoPhotometer®分光光度计，Qubit®3.0 Flurometer，安捷伦 2100 RNA Nano 6000 Assay Kit。

1.2 方法

1.2.1 利用RNA-Seq 数据的差异选择性剪接分析 用1 µg 总RNA 制 备RNA-seq 文 库，去 除DNA，用VAHTS mRNA capture Beads (Vazyme, N401) 捕获总RNA，用RNA clean beans 纯化去除的RNA。利用KAPA 链mRNA-Seq Kit 对RNA 进行碎片化、单链合成、双链合成、末端修复、剪接、扩增、纯化等处理，制备链特异性RNA-seq 文库。最后用Qubit 4.0进行浓度定量，并置于-80 ℃冰箱中保存。进行末端修复和5’接头连接，然后用含有3’接头序列和随机六聚体的RT 引物进行逆转录。对cDNA 进行纯化和扩增，对200-500 bps 的PCR 产物进行纯化、定量处理，-80 ℃保存备用。制备文库后，应用Illunima HiSeq X Ten 系统进行 150 nt 双端高通量测序。利用HISAT2 剪接splice junction，通过ABLas 对HISAT2剪接的splice junction 进行处理。在RNA-seq 文库中，使用Illumina Novaseq 6000 的PE150 模式进行高通量测序。

1.2.2 差异基因功能分析 利用GO 和KEGG 数据库对发现的差异表达基因和差异可变剪接基因进行功能聚类分析。基因本体是描述基因和蛋白质功能的数据库，分为三大类: 分子功能、生物过程和细胞成分。通过GO 分类富集分析，分析了DEG 和RASG 的功能。将GO 数据库中的每个term 投射出相应的DEG和RASG，同时计算相关term 的基因数量。利用超几何分布进行检验，可以获得差异可变剪接基因显著富集的GO 项在全基因组GO 注释的背景下。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG) 是一个资源数据库，可用于从分子水平的信息（特别是通过大分子数据集产生的基因组测序和其他高通量实验技术所获信息）了解相关高级功能和生物系统( 如细胞、生物和生态系统)。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计量资料用均数± 标准差（±s）表示，采用t检验，计数资料用百分比（%）表示，采用χ² 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 质量检测结果

实验结果中样品显示出的碱基质量合格，reads读数的大部分都可以比对到CDS 区域（见图1），并且在基因各部位均匀分布；clean reads 的质量分析显示，Q30 的平均值为96.72%，故该实验中的高通量测序结果可靠。

图1 reads 在基因组上的分布

2.2 差异表达基因

选取银屑病病变组5 例和正常对照组5 例进行高通量测序。整合分析银屑病转录数据集和对照数据集的差异表达基因，利用Fold Change 和pvalue 筛选出差异表达显著的mRNA 和lncRNA。将差异标准设定为P＜0.05 且差异表达倍数大于2 时，共检测到2180 个差异表达基因。银屑病病变组存在差异上调基因906 个，差异下调基因1274 个。火山图显示，两组样本中mRNA 和IncRNA 的表达差异超过2 倍的转录本( 见图2) ；红点表示表达水平上调的基因，蓝点表示表达水平下调的基因，黑点表示表达水平无显著变化的基因。在本次变量剪接分析中，我们采用t检验法比较两个样本中各基因相同剪接类型变量剪接水平的变化，以P值≤0.05 为标准条件进行过滤，显示显著差异。两组样本中共发现差异上调基因1416 个，差异下调基因1629 个。我们对每个样本中的RASG 和DEG 基因进行整合分析，得到246 个表达水平差异显著且剪接水平可变的基因。

图2 差异表达火山图

2.3 差异表达功能富集分析

本研究中通过分析银屑病患者与正常健康者的皮肤样本，并运用RNA-Seq 数据揭示了相关可变剪接的大规模变化。根据基因本体论可分析具有差异性表达的mRNA，进而研究银屑病的发生发展机制（包括生物学过程、细胞组件和分子功能三类）。研究结果显示，在细胞组成中，差异可变剪接基因主要存在于细胞质、细胞核中，表明此类细胞组件可能与银屑病的发病机制密切相关；其中细胞质差异表达的基因有783 个，细胞核差异表达的基因有721 个。在生物学过程中，差异可变剪接基因主要参与脂质代谢过程、RNA 剪接的调节、脂肪酸代谢过程、mRNA 合成过程等。分子功能过程中，差异表达的mRNA 主要参与结合氧化还原酶反应、催化酶反应、裂解酶反应，可以看出参与差异性表达的基因可通过各种生物学过程影响银屑病的发病机制。从分子水平信息角度进行差异可变剪接基因的KEGG pathway 富集性分析可知，差异表达主要富集于代谢途径、黏附连接、脂肪酸代谢等过程中，表明银屑病可变剪接事件的变化与银屑病的发病机制密切相关。

3 讨论

以往的研究表明，可变剪接在银屑病发病机制中具有潜在的作用。例如，TRAF3IP2 的突变亚型可能导致银屑病的形成。TRAF3IP2 基因是导致银屑病IL-17 信号通路的重要适配器。当TRAF3IP2 的N端存在特定的氨基酸替换时，排除外显子2 的亚型TRAF3IP2 失去了转导IL-17 信号调控下游基因表达的能力。这种突变亚型的表达可能会促进IL-22 和IL-17 的过度产生。因此，这种选择性剪接使携带突变诱发者易患银屑病[4]。金莉等人采用了一种基于大规模计算分析的系统生物学方法，利用银屑病小鼠和人类数据集以及一个带有扰动SFs 的RNA-Seq 数据库来生成关于可变剪接在银屑病中潜在作用的生物学假设。这项大规模的分析表明，银屑病中有18 个保守的ES 剪接事件以及几个候选的SFs 可能会调节银屑病中的基因剪接[5]。一项研究显示，NFKBIZ 基因的遗传变异与牛皮癣的发生风险有关，并且其还可能有助于确定对抗TNF 生物药物的反应[6]。基于该基因在抗TNF 药物发生反应中的作用，有必要对相关全转录本和替代转录本的表达差异进行研究。可见，比较抗TNF 治疗前后患者的转录水平也是必要的。通过对转录本可变剪接的分析，可为银屑病的分子机制提供解释，并为新治疗方法的提出铺平道路。本研究的结果表明，lncRNA 的可变剪接变化与多种细胞功能息息相关，同时在银屑病的发病机制中发挥着重要的作用。根据银屑病角质形成细胞转录组分析的结果来看，银屑病的病理改变与炎症反应、细胞角质化及细胞周期等多种因素相关。在细胞生命过程中，细胞周期为必不可少的过程。总的来说，银屑病的病理改变可引起lncRNA 的差异表达，lncRNA 的不同表达作用于不同的细胞通路可引起差异表达基因的失调，二者共同决定了银屑病的发病机制。目前已有研究阐述了选择性剪接的改变在lncRNA 中的贡献。然而，关于特定lncRNA 亚型定位和功能的研究仍然很少。有研究指出，GAS5 lncRNA 经历了广泛的选择性剪接[7]，然而目前尚不清楚众多的GAS5 替代剪接异型中哪一种参与了相关定位模式和功能的调节。除了选择性剪接外，进行lncRNA 转录本的差异处理可能有助于分析独特亚细胞的定位和功能[8]。有实验表明，选择性剪接的差异性改变可能对mRNA 和lncRNA 的分布产生不同的影响，需要通过进一步的研究来充分阐明这些潜在的机制[9]。现在，我们可以大胆猜测银屑病发病过程中存在可受RNA 结合蛋白调控靶基因的作用。进一步探讨这些靶基因的作用机制可为银屑病的治疗提供新的方向。