聂峰杰，甘晓燕，张 丽，巩 檑，刘 璇，杨文静，宋玉霞

（1宁夏农林科学院农业生物技术研究中心，银川 750002；2宁夏农业生物技术重点实验室，银川 750002）

0 引言

沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)是豆科冬青属植物，分布在中国北方荒漠地区抗寒抗旱能力极强的常绿阔叶灌木[1]。沙冬青天然种群分布区狭小，自然更新能力弱，天然种群分布范围呈逐渐萎缩的趋势[2-4]，已被列入第一批珍稀濒危保护植物名录[5]。沙冬青具有耐干旱、耐盐碱、耐风沙、耐低温、耐高温的特性，是优良的天然抗逆基因资源库，已有多个沙冬青耐逆基因研究取得了较大进展，如转录因子AP2/ERF[6]，与抗逆相关的AmFAD2-1[7]，参与应低温和干旱胁迫Bet v 1基因等[8]。沙冬青枝叶具有活血、散瘀、止痛、祛风湿的功效，对风湿性关节炎、冻疮等疾病治疗效果显著[9]，其丰富的生物碱类、黄酮及异黄酮类、有机酸等生物活性物质，具有抗病毒、杀菌、降糖、抗肿瘤、杀虫等作用[9-12]。沙冬青同时具有良好的景观效应，是干旱地区城市园林绿化首选材料。由于其独特的研究应用价值，沙冬青在生物科学研究、城市景观设计、水土保持和改善环境等方面开展了大量的研究和应用，对中国西部地区气候、其他古地中海第三纪孑遗植物物种迁移以及荒漠区动植物演替进程的研究起重要的推动作用。

近年来，沙冬青自然种群和天然分布面积受气候变暖、地理变迁、人为破坏等因素影响急速减少，处于更加濒危状态。目前，为保护种质资源，扩大种群数量，加大资源开发利用沙冬青人工种植规模不断扩大。沙冬青叶部病害发生于春季叶片返青时期，发病率高，侵染速度快，防治不当往往集中连片死亡，造成严重损失。由于沙冬青叶部病害鲜有报道，病原菌生物学特性和种类未知，本研究开展沙冬青叶部病害病原菌的分离和鉴定，田间开展药剂防治研究，以期为沙冬青叶部病害防治提供理论基础和有效的技术措施。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品及沙冬青2021 年在宁夏中宁县轿子山林场沙冬青种质资源圃采集沙冬青发病叶片，采用常规组织分离法分离病原菌。采集中宁轿子山林场种质资源圃沙冬青健康幼嫩枝条用于离体接种材料。

1.1.2 培养基PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉8 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。高氏1号培养基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂8 g，pH 7.4～7.6。PD培养液：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。

1.1.3 试剂和仪器Fungal DNA 提取试剂盒，Omega Bio-Tek 公司；DNA 纯化回收试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞、2×Det PCR MasterMix，天根生化科技（北京）有限公司；D2000 DNA Marker、2×GC Buffer II、dNTP、Taq酶、T4 DNA Ligase、pGEM(R)-TEasy载体，宝生物工程（大连）有限公司；其余试剂均为国产分析纯。BX53 荧 光 显 微 镜，日 本Olympus 公 司；Eppendore 5810R 高速冷冻离心机，德国Eppendore 公司；NanoDrop 2000超微量分光光度计，美国Therom公司；Applied Biosystems 2720 thermal cycler PCR 仪、Applied Biosystems 3730XL测序仪，美国应用生物系统公司；君意JY04S-3C 凝胶成像系统及君意JY300C Power Supply电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司。

1.1.4 供试药剂 波尔多液等铜制剂、福美铁等杀菌剂、75%百菌清可湿性粉剂600 倍液，以清水做对照。喷孔直径为0.8 mm的MATABI Super Green 16型背负式喷雾器。

1.2 方法

1.2.1 病原真菌的分离与纯化 采用组织分离法进行病原真菌分离，单孢纯化法进行病原真菌纯化[13]，25℃培养5～7 d，待菌落长出后用5 mm 打孔器在菌落边缘打孔，菌饼用于致病性接种，另取菌饼保存于15%甘油中-20℃保存备用。

1.2.2 致病性测定 采集一年生沙冬青幼嫩枝条，无菌水冲洗晾干，用灭菌脱脂棉包裹枝条基部，滴上无菌水保湿，选取枝条前端完全展开叶片，每片叶子正面接种1 个菌饼，设6 次重复。将消毒后的托盘铺无菌滤纸，用无菌水浸湿，接种后的枝条斜置于托盘中，喷洒无菌水后用保鲜膜封住托盘，25℃黑暗培养，接种2、5 d后观察叶片发病情况。以叶片产生病斑作为致病性评价指标，对发病组织重新进行病原菌分离纯化，原接种菌株一致的纯化菌株为致病菌株。

1.2.3 致病真菌形态学观察 将纯化后的致病菌株接种于PDA 平板上，25℃黑暗培养5 d 后测量菌落直径，观察并记录菌落形态、颜色、质地等[14]。采用玻片培养检视法进行观察，待致病菌株产生分生孢子与附着胞时，显微镜观测分生孢子形态、菌丝附着胞形态与产孢结构。

1.2.4 致病真菌的分子生物学鉴定 参照Fungal DNA提取试剂盒说明书提取菌株基因组DNA，DNA浓度和纯度用超微量分光光度计检测，以浓度为50 ng/μL 的标准液备用。采用真菌ITS 序列通用引 物 ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG) 和 ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)进行PCR 扩增，引物由北京奥维森基因科技有限公司合成。

50 μL PCR 扩 增 体 系：2×TsingKE MasterMix 25 μL、正反向引物(10 μm)各1 μL、50 ng/μL DNA 1 μL、ddH2O 22 μL。

反应条件：94℃预变性10 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，循环30次；72℃保温10 min。

取2 μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR 产物纯化后由北京奥维森基因科技有限公司测序，使用3730xl对测序数据进行收集。

1.2.5 沙冬青真菌病害的田间防治

（1）施药方法。防治试验设3个处理，重复3次，药剂处理区和对照区面积均为30 m2，清水处理作对照。试验期为春季沙冬青返青长出3～5 片新叶的发病初期。以清水均匀喷施空白为对照区，另划定药剂处理区，以低浓度喷雾处理完成后，洗净喷雾器再进行高浓度喷雾处理，于2021年3月25日、4月4日间隔10 d各喷药1次，共喷2次。

（2）调查方法。第2次施药14 d后调查病情指数，共调查3次。每小区调查10株，记录病叶数和叶片发病指数。

（3）药效计算方法。沙冬青叶斑病分级标准参照文献[15]统计。0 级—无病斑，1 级—病斑面积占叶面积的10%以下，2级—病斑面积占叶面积的11%～30%，3 级—病斑面积占叶面积的31%～50%，4 级—病斑面积占叶面积的50%以上。药效按式(1)～(2)计算。

式中，DI为病情指数，LN为病叶数，RE为相对极值，Ln为调查总叶数，CE为防治效果，DICK为对照区病情指数，DIET为处理区病情指数。

2 结果与分析

2.1 病原真菌分离与致病性测定

对采集到的沙冬青病叶进行病原菌分离纯化，经沙冬青嫩枝接种验证获得1 株致病菌株SDQ。由SDQ 引起的沙冬青病害主要侵染叶部（图1a、1b），造成叶部产生凸起斑点，斑点周围叶片变黄干枯（图1c、1d）。叶部凸起斑点在体式显微镜下观察（图1e、1f）呈不规则盘座状，内部密生分生孢子。将SDQ接种至沙冬青幼嫩枝条叶片上进行致病性测定，接种2 d后接种点可见坏死斑点（图1g），接种5 d后叶部病斑扩大，表现与田间相似症状（图1h）。

图1 沙冬青叶部病害症状

2.2 病原菌的培养特性和形态特征

SDQ 菌株在PDA 和高氏1 号培养基平板上正常生长，28℃黑暗培养5 d 菌落直径8 cm，绒毛状、灰白色、致密气生菌丝，背面呈灰黑色轮纹状（图2a、2b）。经玻片黑暗保湿培养5 d 后菌丝直柔曲状，有隔（图2c、2d）；培养7 d 后产生深色分生孢子梗，以合轴式延伸，顶端单生褐色分生孢子（图2e、2f）。

图2 菌株SDQ的菌落和形态特征

2.3 病原真菌分子生物学鉴定

采用真菌ITS 序列通用引物，对菌株SDQ 进行PCR扩增（图3），得到有效序列587 bp（图4）。测序后对rDNA ITS序列在NCBI中进行序列比对，下载相似性99%及以上序列，通过构建系统发育树（图5），进行系统进化分析，SDQ 与Alternaria alstroemeriaeCBS 118809 ITS region(NR_163 686.1)相似性为99.82%，与Alternaria eichhorniaeATCC 22255 ITS region(NR _111832.1)相似性为99.46% ；与Alternaria destruensATCC 204363(NR_13714 3.1)相似性达到100%。

图3 SDQ ITS扩增结果

图4 沙冬青病原菌ITS序列

图5 基于ITS序列构建的沙冬青病原菌及相关菌株系统发育树

2.4 沙冬青叶部病害的田间防治

沙冬青叶部病害田间药剂防治试验结果（表1）表明，75%百菌清可湿性粉剂和波尔多液2000倍液对病害均有一定的防治效果，其中75%百菌清可湿性粉剂喷施2 次对沙冬青叶部病害的防治效果达到87%，波尔多液2000 倍液的防治效果为57.9%，75%百菌清可湿性粉剂的防治效果优于波尔多液2000倍液。

表1 第2次施药后7 d沙冬青叶部病害防治效果

3 结论

沙冬青具有独特的研究应用价值，在生物科学研究、城市景观设计、水土保持和改善环境等方面对其开展了大量的研究和应用，但对沙冬青的病害鲜有报道。宁夏轿子山林场建立的沙冬青种质资源圃，春季返青时期叶部发生病害，流行性较强，发病速度快，易造成毁灭性危害。本研究从沙冬青叶部斑状组织中分离病原菌，经形态和ITS序列鉴定与A.destruensATCC 204363(NR_13714 3.1)相似性达到100%，初步确定为半知菌亚门丝孢纲丝孢目链格孢属。

由于沙冬青叶部病害在叶部返青时期流行性较强，易造成毁灭性危害。作为首次报道的病害，本研究主要采用不同药剂对沙冬青叶部病害进行田间防治。沙冬青返青长出3～5 片新叶时期，在发病初期连续喷药2 次，间隔10 d，75%百菌清可湿性粉剂喷施2 次的田间防治效果优于波尔多液2000 倍液，防治效果达到87%，可作为沙冬青叶部病害防治药剂选择使用。

4 讨论

链格孢菌A. destruens作为植物病原菌仅在2019年首次报道在中国引起女贞叶斑病[16]，尚无其侵染其他植物的报道。作为夹竹桃科龙胆属植物的内生真菌[17]，A.destruens产生的α-葡萄糖苷酶抑制剂可作为抗菌和抗生物膜制剂。同时，A.destruens已注册为控制菟丝子生物除草剂的有效成分之一[18]，可以与草甘膦、硫酸铵综合治理菟丝子。链格孢属中包括许多植物病原菌，如马铃薯早疫病病原菌A alternate[19-20]，引起胡萝卜黑腐病的A radicina、A carotiincultae、A.atrocariis[21]等病原菌，引起红枣黑斑病的A.alternate和A.tenuissima[22]。链格孢属也是一些植物内生真菌，如在月季上分离到A.alternate和A.tenuissima，其产生的次生代谢产物细交链格孢菌酮酸在适合浓度对月季没有伤害而对月季长管蚜有趋避作用[23]。

A.destruens作为沙冬青叶部病害的病原真菌为首次报道，其致病机理尚不清楚，有必要进一步开展生物学特性、生理生化特性等研究，系统研究病原菌致病机理，为病害的防治奠定理论基础。