王田田，朱文静，盛东亚，聂伟冬，杨 凡，彭 煜

（上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437）

前列腺癌（prostatic cancer, PCa）是男性泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，好发于老年男性。在欧美国家，PCa发病率已超过肺癌，居于男性常见癌症发病率的首位[1]。近几年，我国PCa发病率呈现逐年增长的趋势[2-3]。由于PCa筛查机制及公众认知的缺失，多数患者因尿路疼痛或骨痛就诊时，疾病已发展到中、晚期阶段[4]。晚期PCa易发生骨转移[5]，骨转移患者往往会伴随骨痛、病理性骨折、高钙血症等并发症，且并发症会导致患者生活质量下降，使总体生存率降低[6]。PCa发病机制目前尚不清楚，尽管采用雄激素剥夺疗法（ADT）治疗晚期前列腺癌可获得较好疗效，但由于疾病的进展，最终机体会产生抵抗性，导致内分泌治疗无效。因此确定新靶点、新通路，并研发新药物，具有重要意义。

课题组前期实验已证实了温肾散结法能有效降低前列腺特异性抗原（PSA）水平，缩小骨转移灶，延缓前列腺癌进程[7]。“温肾散结方”（WSSJ方）是全国名老中医彭培初教授根据多年临床实践创制的经验有效方。前期研究发现，WSSJ方具有抑制激素非依赖性前列腺癌PC3细胞生长、迁移、侵袭及促使其凋亡的作用[8]，然而WSSJ方对具有更强转移潜能的DU145细胞、激素依赖性前列腺癌22RV1细胞的影响并未探讨，且WSSJ方阻碍前列腺癌进展的分子生物学机制尚不清楚。天冬酰胺内肽酶（asparagine endopeptidase, AEP）属溶酶体半胱氨酸蛋白酶C13家族的成员[9]，在多种恶性肿瘤中呈高表达，且AEP蛋白的高表达与患者的不良预后相关[10]。磷酸酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（Protein Kinase B, PKB/AKT)信号通路是肿瘤发生的经典信号通路，此信号通路的失调也是引起前列腺癌发生和进展的关键机制[11]。前期实验表明，AEP可通过PI3K/AKT信号通路促进前列腺癌细胞的增殖和侵袭[12]。因此，本研究基于AEP/PI3K/AKT信号通路探讨WSSJ方对人前列腺癌细胞的影响及其分子生物学机制。

1 材料

1.1 主要仪器 细胞培养箱（赛默飞世尔科技有限公司，型号：371）；荧光显微镜（徕卡微系统有限公司，型号：DMi8 automated）；超净台（青岛海尔生物医疗股份有限公司，型号：HR900-ⅡA2）；酶标仪（帝肯贸易有限公司,型号：SPARK）；灭菌锅（松下电器有限公司，型号：MLS-3781L-PC）；显影仪（上海安景科技有限公司，型号：ChemiDocTM MP lmaging System）。

1.2 药物与试剂 温肾散结方实验用冻干粉由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院药学实验室制备；RPMI 1640培养基（批号：8121707）、F12培养基（批号：8121751）、胎牛血清（FBS）（批号：Gibco A99G00K）、双抗（penicillin-streptomycin PS）（批号：Invitrogen 15070063）均购自赛默飞世尔科技有限公司；Cell Counting Kit-8细胞增殖毒性检测试剂盒（批号：K101822133EF5E）购自美国APE×BIO生物科技有限公司；BCA蛋白测定试剂盒（批号：P0009）、4%多聚甲醛溶液（批号：P0099-500 mL）及结晶紫染液（批号：C0121-500ml）均购自碧云天公司；AEP多克隆抗体（批号：R24822）、PI3K多克隆抗体（批号：R22768）、AKT多克隆抗体（批号：38117）均购自上海正能生物有限公式；GAPDH（批号：10494-1-AP）购自美国Proteintech Group，Inc；兔荧光二抗（批号：7074）购自美国Cell Signaling Technology公司；反转录酶试剂盒（AMV Reverse Trancription Kit M5108）购自美国Promega公司。引物序列委托生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 细胞株 人激素非依赖性前列腺癌PC3细胞株、DU145细胞株由上海中医药大学科技创新中心实验室惠赠；人激素依赖性前列腺癌细胞株22RV1（批号：30423）购自中国科学院细胞库。

2 方法

2.1 细胞培养 PC3细胞用含FBS（10%）和PS（1%）的F12培养基培养，DU145和22RV1使用含FBS（10%）和PS（1%）的RPMI 1 640培养基培养，均在37 ℃，5%CO2细胞培养箱中培养。

2.2 CCK8检测细胞活力 取对数生长期的前列腺癌细胞PC3、DU145、22RV1，接种到96孔板中，8×103个/孔，每组设置3个复孔。贴壁后，去除原培养基，分别添加含不同浓度WSSJ方的培养基（PC3：0.00、3.13、5.00、6.25、10.00、12.50 mg/mL；DU145：0.00、2.25、3.13、4.50、6.25、9.00 mg/mL；22RV1：0.00、3.13、5.00、6.25、10.00、12.50 mg/mL）处理，其中0.00 mg/mL为对照组。24 h后检测细胞相对活力，按每孔100 μL培养基中加入10 μL CCK8溶液，并置于细胞培养箱避光孵育2 h，酶标仪在450 nm波长下检测各孔吸光度值，计算其细胞相对活力。细胞相对活力（%）=[（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白组）]×100%。

2.3 细胞形态学观察 取对数生长期的PC3、DU145、22RV1细胞（2×105个/孔），接种于6孔板中，设置对照组、WSSJ方组。贴壁后WSSJ方组更换含药培养基（5 mg/mL），24 h后显微镜下观察细胞形态并拍照记录。

2.4 集落形成检测WSSJ方对细胞增殖能力的影响 取对数生长期的PC3、DU145、22RV1细胞（8×102个/孔）接种至12孔板，设置对照组、WSSJ方低剂量组（0.5 mg/mL）、WSSJ方中剂量组（1.0 mg/mL）、WSSJ方高剂量组（2.0 mg/mL），每3 d更换1次培养液，14 d后，弃培养基，PBS洗3次，多聚甲醛固定15 min；每孔加入0.5 mL结晶紫溶液染色。1 h后弃去染液，用蒸馏水洗涤2次，晾干后观察并扫描12孔板，记录结果。

2.5 划痕实验检测WSSJ方对前列腺癌细胞迁移能力的影响 取对数生长期的PC3、DU145细胞（5×105个/孔）接种于6孔板，分组同“2.3”，贴壁后，用100 μL枪头在6孔板内垂直划痕，PBS冲洗3次，对照组加入无血清培养基，WSSJ方组更换含药（5 mg/mL）无血清培养基，继续培养。按0、6、12、24 h观察，并拍照记录，使用Image J分析愈合面积并计算细胞迁移率。迁移率=（0 h划痕宽度-培养后划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%，划痕宽度平均值=划痕空隙面积/长度。

2.6 实时荧光定量PCR检测细胞内AEP mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA表达 取对数生长期PC3、DU145、22RV1细胞，接种于6 cm皿中，分组同“2.3”，待细胞生长密度达到60%时，对照组正常换液，WSSJ方组更换含药（5 mg/mL）培养基，培养24 h后收集细胞，使用Trizol提取RNA，测纯度、浓度，利用PrimeScript RT Master Mix 将RNA 反转录为cDNA。根据2×SYBR Green Master Mix 5 μL，上下游引物各0.2 μL，模板DNA 1 μL，DEPC水3.6 μL，配制PCR反应体系10 μL，设置3个复孔，上机检测AEP mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA的表达水平。反应条件设置为95 ℃，5 min；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s，40个循环。以GAPDH Ct值为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。

2.7 Western blotting 检测细胞内AEP、PI3K、AKT 蛋白表达 分别取对数生长期的PC3、DU145、22RV1细胞，接种于6 cm皿中，分组及处理同“2.6”，培养24 h后收集细胞，RIPA裂解液冰上裂解细胞30 min，离心取上清，BCA法进行蛋白定量。变性后配置1 μg/μL蛋白浓度的样品100 μL，每孔上样量为10 μL，SDS-PAGE凝胶电泳1 h，200 mA转至PVD膜2 h，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，AEP、PI3K、AKT、GAPDH一抗4 ℃孵育过夜，TBST溶液洗膜3次，10 min/次，加入兔二抗，摇床室温孵育1 h，化学发光法检测目的条带，采用Image J软件对Western blotting条带进行灰度值定量分析。

2.8 统计学方法 采用GraphPad Prism8及SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料采用“均数±标准差”（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组人前列腺癌细胞株细胞相对活力比较 PC3细胞：WSSJ方组（3.13、5.00、6.25、10.00、12.50 mg/mL）细胞相对活力明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；DU145细胞：WSSJ方组（3.13、4.50、6.25、9.00 mg/mL）细胞相对活力明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；22RV1细胞：WSSJ方组（6.25、10.00、12.5 mg/mL）细胞相对活力明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。（见图1）

图1 各组人前列腺癌细胞株细胞相对活力比较（±s，n=3）

3.2 各组人前列腺癌细胞增殖能力比较 WSSJ方组PC3细胞、DU145细胞、22RV1细胞镜下计数与细胞融合情况均低于对照组。（见图2）

图2 各组PC3、DU145、22RV1 细胞形态比较

3.3 各组人前列腺癌细胞集落形成能力比较 WSSJ方低、中、高剂量组PC3细胞、DU145细胞、22RV1细胞集落形成数量均少于对照组，且集落形成数量随给药浓度的升高逐渐减少。（见图3）

图3 各组PC3、DU145、22RV1 细胞集落形成比较

3.4 各组人前列腺癌细胞迁移能力比较 WSSJ方组PC3细胞在20、30 h时细胞迁移率明显低于对照组（P＜0.01）；WSSJ方组DU145细胞在6、12、24 h时细胞迁移率明显低于对照组（P＜0.01）。（见图4～5）

图4 各组PC3、DU145 细胞迁移图

图5 各组PC3、DU145 细胞迁移率比较 （±s，n=3）

3.5 各组人前列腺癌细胞AEP mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA相对表达量比较 WSSJ方组PC3细胞、DU145细胞、22RV1细胞AEP mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA相对表达量显著低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。（见图6）

图6 各组PC3、DU145、22RV1 细胞AEP mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA 相对表达量比较 （±s，n=3）

3.6 各组人前列腺癌细胞内AEP、PI3K、AKT蛋白相对表达量比较 WSSJ方组PC3细胞、AKT相对表达量低于对照组（P＜0.01）；WSSJ方组DU145细胞、22RV1细胞AEP、PI3K蛋白相对表达量均低于对照组（P＜0.05或P＜0.01）。（见图7～8）

图7 各组PC3、DU145、22RV1 细胞中AEP、PI3K、AKT蛋白表达Western blotting 图

图8 各组PC3、DU145、22RV1 细胞AEP、PI3K、AKT 蛋白相对表达量比较 （±s，n=3）

4 讨论

近年来，全球疾病谱发生了很大的变化，如：恶性肿瘤已成为高收入国家居民的主要死亡原因，并且是心血管疾病（CVD）死亡人数的两倍[13]。我国前列腺癌发病率呈持续增长趋势，严重影响我国男性居民健康[14]。前列腺癌的主要治疗方式包括放疗、化疗、手术和雄激素剥夺疗法[15-17]。雄激素剥夺疗法效果虽好，但随着疾病的进展，机体逐渐产生耐药性，最终导致治疗无应答。中药治疗前列腺癌具有多靶点、多通路、副作用小等特点，在延缓疾病进程、缓解癌症骨转移痛、提高患者生存质量方面具有明显的优势[18]。姜黄素[19]、槲皮素[20]、五味子甲素[21]等均被证实能够抑制癌细胞增殖及迁移、促进细胞凋亡。临床上中药制剂与西药联合应用在延缓癌症进展、缓解患者症状方面已呈现出极大的潜力，国内中医院普遍应用此方式治疗肿瘤[22-23]。尽管如此，中医药治疗前列腺癌的研究仍处于探索阶段，未形成完整体系，尚存在很大的发展空间[24]。

彭培初教授认为前列腺癌的发生、发展与肾相关，疾病早、中期寒、痰、瘀阻滞气血，邪气逐渐上升，肾阴耗损，阴虚内热；晚期邪气伤正，肾阳亏虚，“肾虚”贯穿疾病的发展始终。故彭培初教授主张从肾论治[25]，早期应滋补肾阴、活血通络，晚期温补肾阳、化痰散结，并拟定温肾散结方。方中重用熟附片、肉桂为君药，温肾阳、除积冷、通血脉；三棱、制大黄为臣药，行瘀通经、破气散结；麻黄、芥子引阳气、开寒结，宣通利气，化痰散结，相得益彰；诸药合用，共奏温肾化瘀散结通滞之功。

AEP在乳腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤等恶性肿瘤中高表达，且与患者的不良预后相关[10，26-29]。靶向AEP可调控肿瘤细胞的增殖、迁移及凋亡等基本生命进程[30]。PI3K/AKT信号通路是肿瘤相关的经典信号通路，激活PI3K/AKT信号通路会导致癌症的不良进展[31]。研究表明，PI3K/AKT信号通路在激素非依赖性前列腺癌（androgen independent prostate cancer，AIPC）的发生发展中起重要作用[32]。降低AEP蛋白表达，会减少PI3K、AKT蛋白的表达量[12]；降低AKT信号转导能够抑制去势抵抗性前列腺癌细胞的增殖[33]。

本研究结果显示，WSSJ方对人前列腺癌细胞株的细胞相对活力和集落形成能力呈现剂量依赖性抑制，经WSSJ方处理后的前列腺癌细胞迁移能力减弱。WSSJ方组PC3细胞AKT蛋白相对表达量低于对照组，DU145细胞和22RV1细胞AEP、PI3K蛋白相对表达量均低于对照组，且WSSJ方组AEP mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA相对表达量均低于对照组。综上所述，靶向AEP蛋白调控PI3K/AKT信号通路，可能是WSSJ方抑制前列腺癌进展的分子机制之一。值得注意的是，本实验中经温肾散结方处理的AEP蛋白水平降低，但具有酶活性的AEP蛋白却被激活。AEP蛋白的酶活性与pH值存在很强的联系；其在pH值酸性条件下，会进行自体蛋白分解，暴露出具有酶活性的C端，使其成为有催化性质的成熟酶，而在pH值碱性条件下AEP蛋白又会恢复其原酶特性[34]。WSSJ方调控前列腺癌细胞功能的机制是否与AEP蛋白酶活性有关，有待进一步研究。