程潇　徐晨　贾贞　刘娟娟　安虹

摘要 本文根据中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供的能力验证作业指导书以及SN/T 2051—2008、GB/T 38164—2019、SN/T 3730.8—2013 3种方法对2个肉糜样品进行猪源性成分检测，通过参加中国检验检疫科学研究院测试评价中心食品中猪源性成分鉴定能力验证，验证实验室动物源性成分检测的能力，扩大实验室的影响力。结果表明，3种方法均可在样品22-W514中检出猪源性成分，在样品22-K216中未检出猪源性成分，本次能力验证获得满意结果。

关键词 猪源性成分；检测能力验证；食品

中图分类号 TS251.7   文献标识码 A

文章编号 1007-7731（2023）08-0162-03

食品安全关乎生命与健康，随着人类经济社会的持续发展和生活水平的不断提高，人们对食品安全问题提出了越来越高的要求。近些年，随着我国食品市场物品种类的丰富，加工领域的不断创新，食品添加剂的广泛使用，食品真实性、品质鉴定和质量安全等相关问题也逐渐凸现[1]。如何快速鉴别食品的真、伪、优、劣成为食品市场管理的重点和难点。

国内市场上的肉和肉制品的生产与销售中，有些不法商贩会利用掺杂掺假、以次充好等手段欺骗消费者，其中以低价的肉冒充高价的肉最为常见，如用鸡肉冒充猪肉，用猪肉、鸭肉冒充牛、羊肉等[2]。因此，对肉类制品及其加工品进行掺假、掺杂检验十分必要，其重点就是快速、准确地鉴定肉制品品种[3-4]。目前，最常见的动物源性成分检测方法是基于分子生物学检测技术的荧光定量PCR法[5]，本实验室采用3种荧光定量PCR方法，分别对2个样品进行猪源性成分的检测。

1 材料和方法

1.1 试验材料

样品由中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供。样品编号分别为22-W514、22-K216，采用真空密封铝箔袋包装。

1.2 试验试剂

本次能力验证使用GB/T 38164—2019及SN/T 3730.8—2013方法进行猪源性成分检测的引物、探针依据标准中公布的序列进行合成（大连宝生物），使用SN/T 2051—2008方法进行猪源性成分检测，试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。本次试验采用的Premix Ex Taq? （Probe qPCR）、RNase Free水均购自宝生物工程（大连）有限公司，基因组提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 试验设备

7500实时荧光PCR仪（美国ABI公司）；高速冷冻离心机（赛默飞世尔）；电子天平（梅特勒-托利多）；振荡恒温金属浴（赛默飞世尔）；Thermo NanoDrop 2000核酸分析仪（赛默飞世尔）。

1.4 试验方法

1.4.1 样品DNA的提取。根据作业指导书的要求，分别取50 mg处理好的样品放置于2 mL离心管中，每个样品做2个平行试验。按照基因组提取试剂盒说明书要求提取DNA，提取完成后使用Thermo NanoDrop 2000分别对DNA进行测定。

1.4.2 荧光PCR扩增。荧光PCR检测循环条件按照相对应的标准要求进行设置，其中阳性对照用含有猪源性成分的肉制品为模板，阴性对照使用未含有猪源性的肉制品为模板，空白对照用ddH2O代替模板，反应体系均为25 μL。其中GB/T 38164—2019荧光PCR检测循环条件为95 ℃ 10 min；40个循环为95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。SN/T 3730.8—2013荧光PCR检测循环条件为50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；45个循环为95 ℃ 15 s，58 ℃ 1 min。SN/T 2051—2008荧光PCR检测循环条件为95 ℃ 10 s；40个循环为95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s。检测结束后，分别根据扩增曲线和Ct值综合对结果进行判定。

2 结果与分析

2.1 GB/T 38164—2019体系猪源性成分检测结果

图1显示试验空白对照无FAM荧光信号检出，未出现典型的扩增曲线；阴性对照无FAM荧光信号检出，未出现典型的扩增曲线；阳性对照有FAM荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值小于35.0，本次试验有效。样品22-W514，有FAM荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线，Ct值小于35.0；样品22-K216，无FAM荧光信号检出，Ct值大于40.0。依据GB/T 38164—2019判定要求，判定22-W514为阳性样品，22-K216為阴性样品。

2.2 SN/T 3730.8—2013体系猪源性成分检测结果

图2显示实验空白对照无FAM荧光信号检出，无荧光对数增长，Ct值大于40.0；阴性对照无FAM荧光信号检出，无荧光对数增长，Ct值大于40.0；阳性对照有FAM荧光信号检出，且荧光通道出现典型的扩增曲线，Ct值小于30.0，本次试验有效。样品22-W514，有FAM荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线，Ct值小于35.0；样品22-K216，无FAM荧光信号检出，Ct值大于40.0。依据SN/T3730.8—2013判定要求，判定22-W514为阳性样品，22-K216为阴性样品。

2.3 SN/T 2051—2008体系猪源性成分检测结果

图3显示试验空白对照及阴性对照均无FAM荧光信号检出，有VIC荧光信号检出，且Ct值均小于28.0；阳性对照有FAM和VIC荧光信号检出，且荧光通道出现典型的扩增曲线，Ct值均小于28.0，本次试验有效。样品22-W514，有FAM和VIC荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线，Ct值小于35.0；样品22-K216，无FAM荧光信号检出，Ct值大于40.0，有VIC荧光信号检出，Ct值小于35.0。依据SN/T 2051—2008判定要求，判定22-W514为阳性样品，22-K216为阴性样品。

3种不同方法试验结果一致，均判定样品22-W514检出猪源性成分，样品22-K216未检出猪源性成分。

3 讨论

目前，在生物学领域动物源性成分的鉴定方法以核酸分析为主，以核酸为基础的方法包括普通PCR、荧光PCR、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性等。其中荧光PCR技术具有快速、简便、灵敏、高特异性等优点，扩增反应可在线实时监控，尤其是在PCR扩增完成后不需要开盖对扩增产物进行后续处理，极大地降低了交叉污染的可能，从而避免了假阳性结果的出现。由于该方法具有检测时间短、灵敏性高、特异性好等特点，目前已成为肉制品品种鉴别最常用的方法。

分子试验不仅仅会因为实验室气溶胶污染导致最终结果错误，DNA提取过程、体系配制、甚至操作失误等多方面原因也有可能导致試验失败。因此在荧光PCR扩增检测时，不仅仅需要在每一种参数检测过程中设置阳性对照、阴性对照和空白对照，还需要在DNA提取过程中设置试剂提取空白对照，这样就可以避免由于提取试剂盒本身的污染导致后续试验失败。此外，在对动物源性成分鉴定结果进行判定时，不能仅仅根据荧光PCR仪直接给出的Ct值进行判断，还需要结合是否出现扩增曲线以及阈值是否满足要求进行综合判定，以保证最终结果的准确性。目前大多数动物源性成分检测标准还都是基于定性的方法，定量检测的方法研究主要基于高通量的检测方法以及数字PCR，但是这些方法存在着工作量大、操作繁琐、对检验者及设备要求高等缺点，目前还尚未广泛运用在动物源性成分的定量检测中，这就要求对现有设备和技术进行不断升级优化，制定出易于推广的动物源性成分定量检测方法。

本次试验结果表明，选用3种方法均可以对猪源性成分进行正确判定。需要指出的是，3种方法中SN/T 3730.8—2013仅可以对猪源性成分进行鉴定；SN/T 2051—2008可以对猪、牛、羊3种动物源性成分进行鉴定，但是检测过程可以控制在1 h以内；GB/T 38164—2019可以对包括猪、牛、羊在内的20余种动物进行源性成分鉴定，所以在平时的工作中，各实验室可以根据自身的要求选择合适的检测方法。

能力验证是检验实验室水平的重要手段之一[6-7]，根据中国检验检疫科学研究院测试评价中心公布的此次能力验证的结果，样品22-W514和22-K216均获得“满意”结果，证明本实验室具有对食品中猪源性成分进行有效鉴定的能力。

4 参考文献

[1] 宗卉，范万红，温燕辉. 应用多重PCR同时检测牛、羊源性成分[J].中国草食动物，2006，26（6）：21-23.

[2] 萧扬，潘良文. DNA检测技术让掺假肉制品无所遁形[J]. 食品与生活，2014（3）：24.

[3] 黄惠敏，张东升，李岳桦. PCR技术在牛羊肉制品成分鉴定及掺假鉴别中的应用[J]. 食品安全导刊，2016，135（12）：22-23.

[4] 余卉茹，纪艺，彭城，等.肉类掺假检测技术研究进展[J].生物技术进展，2022，12（2）：213-221.

[5] 赵新，王永，兰青阔，等. 荧光定量PCR方法鉴别肉制品中羊源性成分[J].食品工业科技，2015（1）：299-302.

[6] 陈雨欣，朱荣，石建华. 牛肉粉末中猪源性成分定性检测FAPAS能力验证结果与分析[J]. 食品安全质量检测学报，2018，9（20）：5324-5327.

[7] 李俊霞，朱虹霖，周浩，等. 食品中马源性成分定性检测能力验证结果与分析[J]. 食品安全质量检测学报，2020，11（22）：8491-8495.

（责编：王 菁）

作者简介 程潇（1982—），男，安徽六安人，高级工程师。研究方向：食品检验。

收稿日期 2023-02-06