汤晓青 郭玺 万焱 王洁 徐斌 陈瑾 张洁 付海艳 罗煜

调查显示,全球新增约84万例肝癌病例和78万例肝癌死亡病例,仅中国就占病例和死亡总数的50%左右[1,2]。尽管我国肝癌的发病率和死亡率呈显著下降趋势,但庞大的人口基数和快速的人口增长,仍导致新发肝癌患者大量增加[3]。在临床中首选手术治疗,结合放化疗可抑制癌症恶化、延长患者生存期,但因耐药性的产生使疗效不十分满意。中国传统医学中的中药包括动物中药、植物中药和矿物质中药,均为天然产物,以绿色健康低毒著称[4]。复方中药肝清宁是一种我国的民间药方,君药土鳖虫、水蛭,臣药三七、甲珠、鸡内金等均参与肝癌的治疗[5,6],但是该方剂的临床效果研究笔者所见甚少。本研究旨在探讨肝清宁对肝癌细胞、肿瘤恶化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验动物:5只4周龄的SPF裸鼠(18±1)g购自湖南斯莱克景达实验动物公司。实验动物许可证号:SCXK(湘)2019-0004。(2)试剂、耗材:人肝癌细胞MHCC97购自美国ATCC;DMEM培养基购自美国;复方中药肝清宁(土鳖虫30 g、水蛭20 g、三七30 g、甲珠20 g、鸡内金30 g、紫河车45 g、党参30 g、黄芪30 g、茯苓30 g、白术30 g、郁金30 g)由我院药剂室制备。5氟尿嘧啶(5-Fu HPLC>99%,货号:51-21-8)购自西安齐岳生物科技有限公司;CCK8试剂盒购自日本同仁;Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自上海碧云天;Cleaved caspase-3、Cleaved PARP、MMP-3、MMP-9抗体购自上海艾博抗;Transwell小室购自美国corning;ECL发光试剂盒购自上海翌圣生物科技公司;Gallios流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特。

1.2 方法

1.2.1 MHCC97细胞的培养:10%胎牛血清+1%青链霉素的DMEM培养液,在37℃、5%CO2的饱和湿度恒温细胞培养箱中培养48 h,更换新培养基,传代培养。

1.2.2 分组:正常培养的MHCC97细胞为对照组。20、40、80 μg/ml的肝清宁培养的细胞为低浓度组、肝清宁中浓度组、肝清宁高浓度组。肝清宁药液的制备:根据药物在人体内的血药浓度初步推算在细胞中的药物浓度,并在此浓度上下波动设置浓度梯度。用临床用量除以体重估计的血浆容量,算出药物全部吸收时可达到的血浓度,以此为基础做一个浓度梯度。通过预实验-细胞毒性实验,筛选出最适浓度40 μmol/L,取1/2和2倍做为低浓度、高浓度。将所需药物充分粉碎,过200目筛,干燥保存。先制备80 μg/ml的高浓度药液,再倍比稀释为中浓度、低浓度药液,使用前用0.22 μm的滤膜过滤除菌。5-Fu(150 μg/ml)处理MHCC97细胞,作为阳性对照组设为5-Fu组。

1.2.3 细胞增殖能力的检测:①按照CCK8试剂盒检测的说明要求操作:收集各组细胞,分装置96孔板,每孔1 000个细胞,置于细胞培养箱中培养24、48、72 h,然后加入10 μl CCK8反应液,37℃孵育20 min后在450 nm波长下检测吸光度。细胞存活率(%)=(OD490实验组-OD490对照组)/OD490对照组×100%。②克隆形成实验:将细胞制备成单细胞悬液,把细胞均匀接种于培养皿(2 000个细胞),培养2周后会有肉眼可见的小白点。用甲醇固定、结晶紫染色,计算克隆形成数。

1.2.4 细胞凋亡能力的检测:①Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡能力:按照试剂盒说明书要求操作,用冷PBS冲洗细胞,重悬,加500 μl结合缓冲液悬浮。加入Annexin V-FITC、PI染料各5 μl,避光孵育20 min,流式细胞术检测分析细胞的凋亡情况。总凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。②WB实验检测凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved PARP的表达:RIPA、超声裂解充分裂解细胞,提取蛋白,进行定量变性后,取上清用于蛋白电泳。先准备下层的分离胶,灌胶,擦去气泡,再准备上层的浓缩胶,凝固后,加样。先稳流,45 A电泳1 h左右,条带下缘至分离胶上缘,再进行稳压电泳,电压调至220 V,约2 h左右,条带至分离胶下缘1 cm,关闭电泳仪。将胶上的蛋白用转膜仪湿转至PVDF膜,并用封闭液37℃封闭处理2 h。结束后将膜浸入一抗稀释液(1 500倍稀释的兔抗人Cleaved caspase-3、Cleaved PARP多抗)中,37℃孵育4 h,洗膜后转移至稀释的二抗溶液(500倍稀释的山羊抗兔二抗)中,37℃孵育2 h。结束后用ECL发光液显影、曝光。Image J分析蛋白灰度。

1.2.5 细胞迁移侵袭能力的检测: ①Transwell实验检测细胞迁移侵袭能力:对待测细胞饥饿处理24 h,取200 μl约10 00个细胞均匀涂抹于上室表面,下室加入600 μl含血清的培养液,培养24 h。取出小室上膜,固定,染色,显微镜下观察计数,拍照。细胞侵袭能力检测使用含有基质胶的Transwell小室。②划痕实验检测细胞侵袭能力:先对细胞饥饿处理24 h,准备划线的培养板。接种相同量的细胞,并用牙签划痕,镜下记录划痕的宽度(mm)。培养24 h后,取出镜下观察,划痕的宽度(mm)。划痕愈合率(%)=(0 h宽度-24 h宽度)/0 h宽度×100%。③Western blot实验检测细胞MMP-3、MMP-9蛋白表达:按照1.4中的WB实验流程操作。所用一抗为2000倍稀释的兔抗人MMP-3、MMP-9多抗,二抗为500倍稀释的山羊抗兔二抗。

1.2.6 肿瘤的异种移植:将5只裸鼠,右前肢皮下接种0.5 ml约1 000个细胞,足料足水饲养。分别设为对照组、肝清宁低浓度组、肝清宁中浓度组、肝清宁高浓度组、5-Fu组。次日,肝清宁(55.36、27.68、13.84 g生药/kg)灌胃给药,1次/d,连续4周。对照组同时灌胃等量0.9%氯化钠溶液,5-Fu组肌内注射30 μg/kg 5-Fu,1次/d,连续5 d,之后剂量减半,隔日1次。4周后,游标卡尺测量肿瘤的最长直径、最短直径(mm),断颈法处死裸鼠,剥离瘤子,称重(g)。

2 结果

2.1 不同浓度肝清宁对肝癌MHCC97细胞存活率的影响 与对照组比较,肝清宁(低、中、高)浓度组细胞在24 、48、72 h的存活率均显著降低,细胞的克隆形成量显著降低(P<0.05);与肝清宁低浓度组比较,肝清宁中浓度组、肝清宁高浓度组细胞在24 、48、72 h的存活率和克隆形成量显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 不同浓度肝清宁对肝癌MHCC97细胞存活率的影响

2.2 不同浓度肝清宁对肝癌MHCC97细胞凋亡率的影响 与对照组比较,肝清宁(低、中、高)浓度组细胞凋亡率均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与肝清宁低浓度组比较,肝清宁中浓度组、肝清宁高浓度组细胞凋亡率均显著升高(P<0.05),差异有统计学意义。见图1,表2。

图1 流式细胞术检测肝癌MHCC97细胞凋亡

表2 不同浓度肝清宁对肝癌MHCC97细胞凋亡率的影响 n=9,

2.3 不同浓度肝清宁对肝癌MHCC97细胞凋亡通路蛋白表达的影响 与对照组相比,肝清宁(低、中、高)浓度组细胞Cleaved caspase-3和Cleaved PARP的蛋白表达量均显著升高(P<0.05);与肝清宁低浓度组比较,肝清宁中浓度组、肝清宁高浓度组细胞Cleaved caspase-3和Cleaved PARP的蛋白表达量均显著升高(P<0.05)。见图2,表3。

图2 Western blot检测肝癌MHCC97细胞中Cleaved caspase-3和Cleaved PARP表达

表3 不同浓度肝清宁对肝癌MHCC97细胞凋亡率的影响

2.4 不同浓度肝清宁对肝癌MHCC97细胞迁移和侵袭和影响 与对照组相比,肝清宁(低、中、高)浓度组细胞迁移数、侵袭数和划痕愈合率均显著降低(P<

0.05);与肝清宁低浓度组比较,肝清宁中浓度组、肝清宁高浓度组细胞迁移数、侵袭数和划痕愈合率均显著降低(P<0.05)。见表4。

表4 不同浓度肝清宁对肝癌MHCC97细胞基质金属蛋白的影响

2.5 不同浓度肝清宁对肝癌MHCC97细胞基质金属蛋白的影响 与对照组相比,肝清宁(低、中、高)浓度组细胞MMP-3、MMP-9蛋白表达均显著降低(P<0.05);与肝清宁低浓度组比较,肝清宁中浓度组、肝清宁高浓度组细胞MMP-3、MMP-9蛋白表达均显著降低(P<0.05)。见图3,表5。

图3 Western blot检测肝癌MHCC97细胞中MMP-3和MMP-9表达

表5 不同浓度肝清宁对肝癌MHCC97细胞基质金属蛋白的影响 n=9,wt%,

2.6 不同浓度肝清宁对肝癌MHCC97细胞移植瘤的影响 与对照组比较,肝清宁(低、中、高)浓度组裸鼠移植瘤质量和体积均显著降低(P<0.05);与肝清宁低浓度组比较,肝清宁中浓度组、肝清宁高浓度组裸鼠移植瘤质量和体积均显著降低(P<0.05)。见表6。

表6 不同浓度肝清宁对肝癌MHCC97细胞移植瘤的影响

3 讨论

土鳖虫、水蛭、三七等均在肿瘤的恶化进程中均具有抑制作用[7]。土鳖虫性寒、微毒,中医认为以毒攻毒可达到抗癌的作用,通过阻断癌细胞G2/M期而抑制其增殖,促进其凋亡,发挥抗癌功效,此外还在体内促进肿瘤组织中细胞的凋亡,抑制肿瘤的生长,甚至土鳖虫醇提物还抑制肝癌细胞的增殖,促进其凋亡,展现抗肿瘤作用[8]。有研究称,水蛭含药血清具有明显的抑制胰腺癌细胞增殖、迁移侵袭的作用,产生这种作用与下调VEGF的含量有关[9],且水蛭提取物以剂量依赖性方式抑制肝癌细胞的增殖,诱导肝癌细胞凋亡[10]。而土鳖虫、水蛭是肝清宁的主要组成成分。三七作为肝清宁的主要成分之一,其在肝清宁抗肝癌中的作用也不可小觑[11]。

赵凯丽[12]研究报道,复方肝清宁给药后,明显的抑制了小鼠肿瘤的体积和质量,并且肿瘤生长抑制的程度与药物浓度呈正相关性。本研究结果显示,不同浓度的肝清宁可抑制肝癌细胞增殖、迁移侵袭,促进癌细胞的凋亡,并且上调了Cleaved caspase-3、Cleaved PARP,下调了MMP-3、MMP-9,该药的最适浓度为肝清宁中剂量浓度40 μg/ml。除此之外,为了进一步验证肝清宁对肝癌的抑制作用,通过异种移植裸鼠成瘤实验发现,肝清宁明显的抑制了肿瘤的生长,再次说明了肝清宁在肝癌中的抑癌效果。

综上所述,肝清宁抑制肝癌细胞增殖、迁移侵袭,促进癌细胞凋亡,抑制肿瘤的生长,为肝清宁在肝癌治疗中的临床应用奠定实验基础。