景赞，吕雪梅，刘超

乐山市食品药品检验检测中心（乐山 614000）

三聚氰胺（melamine）俗称密胺、蛋白精、蜜胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物[1]，常用作化工原料。因其对人体有害，故不可用于食品加工或作为食品添加剂。

基质效应是指检测系统检测样品中的分析物时，处于分析物周围的所有非分析物质对分析物参与反应的影响。基质效应产生的原因与4个主要因素的相互作用密切相关，即仪器的设计、试剂的组成成分、测试方法的原理、质控材料的组成及处理技术。液相色谱-质谱联用技术是将分离性能优异液相色谱串联专属、能提供相对分子量和结构信息的质谱法的一种快速、灵敏、准确的现代分离分析技术，而且被广泛用于定量分析复杂基质中的物质[2-4]。串联质谱特异性强，同时数据表明质谱的检测需要避免基质效应[5-9]，否则会影响其检测准确性。

试验采取内标法[10-12]消除三聚氰胺的基质效应，内标法是一种间接或相对的校准方法。在测定样品中三聚氰胺含量时，加入三聚氰胺内标物质以校准和消除基质效应对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。

试验引入单因素方差分析及基质效应的评价方法具体量化液质联用检测酸奶、液态奶中三聚氰胺基质效应大小，为研究和消除因检测过程引起的基质效应提供量化指标。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

ME104E电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；DGU20A-API4500液质联用仪（美国AB SCIEX公司）；HSC-12A氮吹仪（北京佳航博创科技有限公司）；VM24固相萃取仪（天津艾杰尔科技有限公司）；HT190R高速台式冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；SHA-B水浴恒温振荡器（长州冠军仪器制造头有限公司）；KQ3200E超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；WCX前处理小柱[60 mg/3 mL沃特世科技（上海）有限公司]、Cleanert PCX前处理小柱（60 mg/3 mL天津艾杰尔科技有限公司）、Bond Elut Plexa PCX前处理小柱（60 mg/3 mL安捷伦科技有限公司）。

1.2 材料与试剂

乙腈、甲醇（均为色谱纯）；三氯乙酸（分析纯）；液态奶（金典、特仑苏、伊利纯牛奶、蒙牛纯牛奶、三元纯牛奶、光明乳业、旺仔、新希望、圣牧、QQ星）和酸奶（安慕希、纯甄、莫斯利安、君乐宝、光明乳业、德亚、冠益乳、新希望初心、简爱、人养一头牛），均购于超市；三聚氰胺标准品（99.4%，批号G976694，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；三聚氰胺-13C3（100 μg/mL，坛墨质检科技股份有限公司）。

1.3 样品处理

采用GB/T 22388——2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》“4.4.1.1”提取、“4.4.2”净化。

1.4 三聚氰胺标准储备液

准确称取10 mg三聚氰胺标准品至10 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混匀后备用。

1.5 三聚氰胺标准及内标中间液

1.5.1 三聚氰胺标准中间液

准确移取25 μL三聚氰胺标准储备液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混匀后备用。

1.5.2 三聚氰胺内标中间液

准确移取250 μL三聚氰胺标准储备液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混匀后备用。

1.6 液相色谱-质谱/质谱条件

液相色谱及质谱条件参照GB/T 22388——2008。

1.7 基质效应评价方法

运用定量测定空白基质提取液与纯溶剂中同浓度分析物的离子响应程度，通过式（1）计算二者比值评价基质效应。

式中：A和B为基质溶液和纯溶剂分析物的峰面积。A/B＜80%，对分析物的响应产生抑制作用；A/B＞120%，对分析物的响应产生增强作用；80%＜A/B＜120%，不存在基质效应。

1.8 统计分析

所有数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 取样量对基质效应的影响

10种液态奶和10种酸奶每个样品分别取样品0.50 g和1.00 g（精确至0.01 g）按照1.3样品处理，按照1.6测定并记录峰面积。结果见表1，图1和图2。

图1 取样量对酸奶三聚氰胺ME的影响

图2 取样量对液态奶三聚氰胺ME的影响

表1 取样量对三聚氰胺ME的影响

表1为取样量对酸奶、液态奶中分析三聚氰胺ME的统计分析结果。结合图1和图2可知，取样量对分析酸奶、液态奶中三聚氰胺ME存在显著性差异。因此取样量是影响液态奶、酸奶中三聚氰胺ME的主要因素之一。由图1进一步可以得出，取样量0.50 g和1.00 g对酸奶中三聚氰胺的ME分别为21.4%～32.5%和10.3%～23.1%。由图2进一步可以得出，取样量0.50和1.00 g对液态奶中三聚氰胺的ME分别为23.6%～39.0%和14.7%～27.4%。

2.2 溶剂种类对基质效应的影响

10种液态奶和10种酸奶每个样品分别取4份样品各1.00 g（精确至0.01 g），每种液态奶和酸奶的每份样品依次加入10 mL水、6 mL三氯乙酸（1%）和4 mL水、10 mL三氯乙酸（1%）、8 mL三氯乙酸（1%）和2 mL乙腈，每个样品超声提取10 min后，按照1.3处理，按照1.6测定并记录数据。结果见表2，图3和图4。

图3 不同溶剂对酸奶三聚氰胺ME的影响

图4 不同溶剂对液态奶三聚氰胺ME的影响

表2 溶剂种类对ME的影响

表2为不同溶剂对酸奶、液态奶中三聚氰胺ME的统计分析结果。结合图3和图4可知，溶剂种类对分析物的ME差异性除三氯乙酸与三氯乙酸-乙腈体积比4∶1之间无显著性差异，其余均有显著差异。因此溶剂种类是影响液态奶中三聚氰胺ME的主要因素之一。由图3进一步可以得出，水、乙腈-水体积比3∶2、三氯乙酸和三氯乙酸-乙腈体积比4∶1对酸奶中三聚氰胺的ME分别为25.9%～36.7%，19.0%～31.3%，6.5%～19.0%及10.0%～22.7%溶剂。由图4进一步可以得出，乙腈∶水=3∶2、三氯乙酸和三氯乙酸∶乙腈=4∶1对液态奶中三聚氰胺的ME分别为34.8%～46.7%、25.5%～37.6%、12.7%～25.9%及14.3%～27.3%溶剂。提取溶剂种类对分析物的ME差异性除三氯乙酸与三氯乙酸∶乙腈= 4∶1无显著性差异。其余均有显著差异。

2.3 溶剂用量对基质效应的影响

10种液态奶和10种酸奶每个样品分别取3份样品各1.00 g（精确至0.01 g），每份样分别加入4 mL三氯乙酸（1%）和1 mL乙腈、8 mL三氯乙酸（1%）和2 mL乙腈、12 mL三氯乙酸（1%）和3 mL乙腈。剩余按照1.3处理，按照1.6测定并记录数据。

表3为溶剂用量对酸奶、液态奶中三聚氰胺ME的统计分析结果。结合图5和图6可知，溶剂用量对分析液态奶、酸奶中三聚氰胺ME除10 mL与15 mL无显著性差异，其余均存在显著性差异。因此取样量是影响液态奶、酸奶中三聚氰胺ME的主要因素之一。由图5进一步可以得出，溶剂用量为5，10和15 mL对液态奶中三聚氰胺的ME分别为21.5%～34.3%，10.8%～23.7%和7.5%～20.4%。由图6进一步可以得出，溶剂用量为5，10和15 mL对液态奶中三聚氰胺的ME分别为28.8%～41.9%，14.2%～27.5%和11.6%～24.7%。

图5 溶剂用量对酸奶三聚氰胺ME的影响

图6 溶剂用量对液态奶三聚氰胺ME的影响

表3 溶剂用量对ME的影响

2.4 不同浓度三聚氰胺对基质效应的影响

分别取10种液态奶和10种酸奶各3份样品1.00 g（精确至0.01 g），每种液态奶的每份样品分别编号为1号（液态奶、酸奶名称），2号（液态奶、酸奶名称）和3号（液态奶、酸奶名称）。按照1.3处理。处理后取0.1 μL三聚氰胺标准储备液加入1号（液态奶、酸奶名称）摇匀；取0.5 μL三聚氰胺标准储备液加入2号（液态奶、酸奶名称）摇匀；取1.0 μL三聚氰胺标准储备液加入3号（液态奶、酸奶名称）摇匀。按照1.6测定并记录数据。

表4为不同浓度三聚氰胺对酸奶、液态奶中三聚氰胺ME的统计分析结果。结合表4，图7和图8可知，不同浓度三聚氰胺对分析液态奶、酸奶中三聚氰胺ME不存在显著性差异。由图7进一步可以得出，10，50和100 ng/mL不同浓度三聚氰胺对酸奶中三聚氰胺的ME分别为12.5%～25.0%，14.6%～23.6%和12.2%～20.4%。由图8进一步可以得出，0，50和100 ng/mL不同浓度三聚氰胺1对液态奶中三聚氰胺的ME分别为14.2%～27.1%，15.5%～26.6%和15.0%～27.5%。

图7 不同浓度三聚氰胺对酸奶三聚氰胺ME的影响

图8 不同浓度三聚氰胺对液态奶三聚氰胺ME的影响

表4 不同浓度三聚氰胺对ME的影响

2.5 SPE小柱对基质效应的影响

分别取10种液态奶和10种酸奶各4份平行样品1.00 g（精确至0.01 g），每份样品过前处理小柱时分别为待净化液不过柱、待净化液过WCX前处理小柱、待净化液过Cleanert PCX前处理小柱、待净化液过Bond Elut Plexa PCX前处理小柱。按照1.6测定并记录数据。

表5为SPE小柱对酸奶、液态奶中三聚氰胺ME的统计分析结果。结合表5与图9、图10可知不过住与过SPE小柱之间存在显著性差异；过SPE小柱之间不存在显著性差异。由图9进一步可以得出SPE小柱类型：不过柱、WCX、Cleanert PCX和Bond Elut Plexa PCX对酸奶中三聚氰胺的ME，分别为4.3%～20.7%、10.4%～23.3%、9.9%～22.7%和9.9%～23.1%。由图9进一步可以得出SPE小柱类型中，不过柱、WCX、Cleanert PCX和Bond Elut Plexa PCX对液态奶中三聚氰胺的ME分别为9.3%～22.2%、14.7%～27.6%、14.3%～27.0%和14.3%～27.4%。

图9 SPE小柱对酸奶三聚氰胺ME的影响

图10 SPE小柱对液态奶三聚氰胺ME的影响

表5 SPE小柱对液态奶、酸奶三聚氰胺ME的影响

表6 三聚氰胺线性方程

2.6 基质效应的消除

绘制标准曲线。分别移取不同体积的三聚氰胺中间液及相同体积的三聚氰胺标准中间液至6个25 mL容量瓶中，用50%甲醇水定容至刻度，得到质量浓度依次为10，20，40，80，160和200 ng/mL的三聚氰胺标准工作液，每毫升三聚氰胺标准工作液中含有三聚氰胺内标浓度为20 ng/mL。以三聚氰胺浓度为横坐标作图，三聚氰胺峰面积/内标峰面积为纵坐标得标准曲线回归方程。

称量9份空白样品至9个50 mL离心管中，加入20 μL内标中间溶液，分别加入25.0，50.0和100.0 μL三聚氰胺标准中间溶液，做三水平三平行回收试验，其余步骤按1.3。

将加标三聚氰胺峰面积/内标峰面积代入，得到三聚氰胺线性的回归方程y=0.634x+0.185 2，得出计算浓度，数据如表7和表8。

表7 酸奶样品三聚氰胺回收率

表8 液态奶样品三聚氰胺回收率

从表7与表8可知酸奶、液态奶在低、中、高3个水平均很大程度上降低基质效应，回收率在100%～110%之间。因此内标法对三聚氰胺ME的消除具有显著效果。

3 结论

从取样量、溶剂种类、溶剂用量、不同浓度三聚氰胺和SPE小柱这5个因素研究对液态奶、酸奶中三聚氰胺的基质效应。结果表明，对液态奶、酸奶三聚氰胺基质效应的影响相差较为明显。可能是不同公司对液态奶、酸奶的配方不同、制作工艺不同、采用的配方及牛奶原料种类不同，因此液态奶、酸奶中三聚氰胺的基质效应起伏变化比较明显。单因素方差分析表明：取样量对分析的ME差异显著，提取溶剂种类对分析物的ME差异性除三氯乙酸与三氯乙酸-乙腈体积比4∶1之间没有显著性差异，不存在基质效应；提取溶剂用量10 mL与15 mL之间差不存基质效应；不同浓度三聚氰胺不存在基质效应；过SPE小柱之间不存在基质效应；其余因素均存在明显基质效应。