李小凤,阮志华,石勇丽,武晓倩,韦 悠,万丽军,谢志勤,任红玉,谢芝勋

(广西兽医生物技术重点实验室/广西兽医研究所/农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室,南宁 530001)

【研究意义】禽腺病毒(FADV)属于腺病毒科腺病毒属,可分为5种基因型(FADV-A～FADV-E)及12个血清型(1～7,8a,8b,9～11)[1-2]。1987年禽腺病毒疫病在巴基斯坦发生,随后在世界各地暴发流行,传播速度快且致死率高[3]。2015年我国山东暴发血清4型禽腺病毒疫病[4]。血清4型禽腺病毒(FAdV-4)主要攻击3～6周龄肉鸡,传染率高,并引起严重的心包积水肝炎综合征(HHS),其典型症状是肝脏肿胀、局部坏死且伴有点出血,心脏包囊肿大,内含透明黄色液体,给家禽业造成重大经济损失[1],FAdV-4 的Ⅷ蛋白(Protein Ⅷ,pⅧ)属于核衣壳蛋白,具有稳定病毒粒子结构的作用[5],但至今对有关FAdVs复制过程中pⅧ与宿主间的相互作用了解甚少。因此,从天然免疫视角探讨FAdV-4 pⅧ对宿主天然免疫相关基因mRNA表达量的影响,明确pⅧ的作用及解析FAdV-4编码蛋白与宿主天然免疫激活的关联机制,对进一步阐释FAdV-4致病机理具有重要意义。【前人研究进展】FAdV-4基因组由43～45 kb双链DNA组成,编码13个结构蛋白和11个非结构蛋白,这些蛋白参与子代腺病毒的衣壳形成、DNA组装和成熟[6]。在FAdV-4编码产物中,hexon蛋白具有中和表面抗原的功能,是血清分型的主要蛋白[7]。Penton蛋白可与细胞内其他蛋白结合,而介导病毒进入细胞[8]。Fiber蛋白包括长纤突蛋白(fiber-1)和短纤突蛋白(fiber-2),其中,fiber-2具有良好的抗原性,可诱导保护性抗体产生,有效抵抗腺病毒感染[9],是疫苗研制和检测试剂盒研发的首选蛋白[10]。100K蛋白协助hexon蛋白组装折叠成三聚体结构,促使新的病毒粒子产生[11]。可见,FAdV-4编码蛋白在影响病毒感染复制过程中发挥重要作用。宿主的先天免疫系统是抵御病原体的第一道防线,在细菌、病毒等病原微生物的病原体入侵时,宿主细胞表面的模式识别受体(Pattern recognition receptor,PRR)精确辨别病原体,并激活先天免疫系统发生级联反应,诱导分泌细胞因子以抵抗病毒复制[12-14]。模式识别受体包括Toll样受体(Toll-like receptors,如TLRS、TLR3、TLR5和TLR9)、RIG样受体(RIG-I like receptors,如RIG-I和MDA5)和DNA受体(Deoxyribonucleic acid like receptors,如IFI16和cGAS-STING)等。其中,病原DNA被胞质中的DNA感受器cGAS识别并结合,生成能转导信号的2′,3′-cGAMP。2′,3′-cGAMP将上游接收到的信号传递给接头蛋白STING。随后STING招募TANK连接酶1(TBK1)[15-16],并使TBK1蛋白磷酸化,为干扰素调节因子7(IRF7)提供结合平台,促使Ⅰ干扰素和细胞因子表达,进而抑制病毒复制[17];MDA5识别病毒RNA,激活转录因子NF-κB,同时招募TBK1,促进IRF7磷酸化,活化的IRF7和NF-κB进入细胞核,诱导核内干扰素和炎性细胞因子的转录和表达,从而抑制病毒复制。蛋白是细胞生理功能的具体执行者,通常以蛋白复合体或与核酸相互作用的形式发挥作用[18]。在病毒复制过程中,病毒蛋白与宿主蛋白间的相互作用对疾病产生、发展和转归起关键作用。【本研究切入点】FAdV-4全病毒感染鸡肝癌细胞(LMH)后可促进天然免疫相关基因表达,表明FAdV-4感染对宿主天然免疫具有调控作用[19-20],但FAdV-4 pⅧ是否参与调控宿主的天然免疫作用尚未清楚,需要进一步探究。【拟解决的关键问题】以pⅧ为研究对象,构建pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒并转染LMH细胞,利用实时荧光定量PCR检测12种天然免疫因子的转录水平,探明FAdV-4 pⅧ和宿主天然免疫间的相互作用,为进一步阐释FAdV-4感染致病机制和免疫应答机理提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

病毒与细胞:FAdV-4(FAdV-4-GX2019-010株)、LMH细胞和PEF1α-HA载体均由广西兽医生物技术重点实验室保存提供。主要试剂及仪器:2×TransTaq-T PCR Super Mix、病毒DNA/RNA纯化试剂盒和大肠杆菌DH5α感受态细胞均购自全式金(北京)生物技术有限公司,T4DNA连接酶、EcoR Ⅰ和KpnⅠ限制性内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公司,DMEM/F12细胞培养基和胎牛血清(FBS)购自美国赛默飞世尔科技有限公司,Universal Genomic DNA Kit购自北京康为世纪生物科技公司,Gene JET RNA Purification Kit和2×SYBR Green Master Mix购自美国英杰生命技术公司;凝胶成像分析仪(型号Gel DocTMXR+)购自美国Bio-Rad公司,超微量分光光度计(型号NanoDrop2000)和实时荧光定量PCR仪(型号Quant Studio 5)购自美国赛默飞世尔科技公司,倒置荧光显微镜(型号ECLIPSETi2-U)购自日本Nikon公司。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计与合成 参考广西兽医生物技术重点实验室分离FAdV-4-GX2019-010株(登录号MW439040)已测得的Ⅷ基因编码区序列,利用Oligo 7.37软件设计PCR扩增引物。上游引物为5′-ccg-gaattcGGATGAACCTCTTGAACGCCGCACCC-3′(下划线为EcoRⅠ酶切位点),下游引物为5′-cccggtaccTTAACCCTGCCAGAACACCGG-3′(下划线为KpnⅠ酶切位点),引物委托深圳华大基因公司合成。

1.2.2Ⅷ基因编码区序列PCR扩增 按照病毒DNA/RNA纯化试剂盒说明对FAdV-4病毒液样本进行DNA提取。以提取的DNA为模板对FAdV-4基因编码区序列进行PCR扩增。反应体系50 μL:2×TransTaq-T PCR Super Mix 25 μL,上、下游引物各2 μL(引物浓度10 μmol/L),DNA模板3 μL,无核酸酶水18 μL。扩增程序:95 ℃预变性3 min;95 ℃ 30 s,56 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,进行34个循环;72 ℃终延伸5 min。1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.2.3 pEF1α-HA-Ⅷ表达载体构建 参照E.Z.N.A Gel Extration Kit试剂盒说明对目的片段进行胶回收,将胶回收产物与pMD18-T载体于16 ℃连接过夜,将连接产物转化至DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,进行双酶切鉴定,将鉴定正确的样品送至深圳华大基因公司测序,测序正确的菌株按照Plasmid Mini Kit说明提取质粒(重组克隆载体),置于-20 ℃保存备用。pEF1α-HA载体和重组克隆载体同时采用EcoRⅠ与KpnⅠ限制性内切酶于37 ℃双酶切4 h,切胶回收目的片段,并将二者16 ℃连接过夜,连接产物转化至DH5α感受态细胞,提取质粒,将双酶切及测序验证均正确的重组表达质粒命名为pEF1α-HA-Ⅷ。

1.2.4 pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒转染LMH细胞 按1×106个/mL的细胞数量接种LMH细胞于6孔细胞培养板,长至单层后弃掉培养基。将去内毒素质粒pEF1α-HA-Ⅷ(试验组)和pEF1α-HA(对照组)按照Lipfectamine 3000 Transfection Kit试剂盒说明转染LMH细胞(1 μg/孔),作用2 h,补加2 mL培养基继续培养,按试验需求收集细胞样品,每组设3个重复。

1.2.5 Western blotting和间接免疫荧光验证 重组蛋白样品经SDS-PAGE分析后转印至PVDF膜上,用4%脱脂乳室温封闭4 h,分别加入1∶2000稀释的HA标记小鼠源单克隆抗体,4 ℃过夜孵育,次日用PBST洗膜4次,再分别加入1∶2000稀释的HRP标记山羊抗鼠二抗,室温孵育1 h,用PBST洗膜4次,用DAB增强型试剂显色拍照。

重组质粒转染LMH细胞48 h后,弃除培养基,依次加入4%多聚甲醛、通透液(Triton X-100)和封闭液,500 μL/孔,每一种试剂单独孵育15 min。弃除封闭液,按500 μL/孔加入HA标记小鼠源单克隆抗体(1∶500),4 ℃过夜孵育。弃除一抗,PBS洗3遍,按500 μL/孔加入FITC标记兔抗鼠二抗(1∶1 000),室温孵育1 h。弃除二抗,PBS洗3遍,用倒置荧光显微镜观察结果。

1.2.6 实时荧光定量PCR测定天然免疫基因 参照Gene JET RNA Purification Kit抽提试剂盒说明进行RNA抽提,用超微量分光光度计测定浓度,进行一步法反转录。反转录体系20 μL:5×PrimeScript RT Master Mix 4 μL,RNA 1 μg,无核酸酶水补至20 μL。每个基因进行3次生物学重复。反转录程序:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。以得到的cDNA稀释10倍后为模板进行实时荧光定量PCR检测,反应体系20 μL:2×SYBR Green Mix 10 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL,cDNA模板2 μL,RNase-free水6 μL。扩增程序:50 ℃激活2 min,95 ℃预变性2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,60 ℃ 1 min,进行40 个循环。每个样品重复3次。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因[20-21],检测STING、MDA5、TBK1、MAVS、NF-κB、IRF7、IFN-α、INF-β、IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β的转录水平,引物信息见表1。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences information

1.3 统计分析

将获得的试验组和对照组目的基因及β-actin的Ct值代入2-ΔΔCt中计算相对表达量,用SPSS 2.0对试验数据进行差异显著性分析,并以Prism 8.0制图。

2 结果与分析

2.1 Ⅷ基因编码区序列PCR扩增及产物鉴定

以反转录合成的cDNA为模板,PCR扩增产物经琼脂糖凝胶分离可获得大小约760 bp的条带(图1),与预期结果相符。测序结果显示,FAdV-4的Ⅷ基因开放阅读框(ORF)长744 bp,共编码247个氨基酸残基,与GenBank的血清4型禽腺病毒Ⅷ基因(登录号MN577984.1)核苷酸序列相似性为100%。

M: DL 2000 DNA Marker;1～4: Ⅷ基因扩增产物。M:DL 2000 DNA Marker; 1-4: Ⅷ gene PCR amplification products.图1 FAdV-4 Ⅷ基因PCR扩增电泳Fig.1 Electrophoretic profile of FAdV-4 Ⅷ gene PCR amplification

2.2 pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒双酶切鉴定

pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒经双酶切鉴定后得到744和4622 bp 2个片段,说明Ⅷ基因目的片段已正确插入pEF1α-HA载体(图2)。深圳华大基因公司测序结果显示插入的Ⅷ基因大小、位置、阅码框架均正确,说明pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒构建成功。

M: Trans 8K DNA Marker;1～4: pEF1α-HA-Ⅷ双酶切产物。M: Trans 8K DNA Marker; 1-4:Double enzyme digestion of pEF1α-HA-Ⅷ products.图2 pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒双酶切鉴定Fig.2 Double enzyme digestion of pEF1α-HA-Ⅷ recombinant plasmid

2.3 Ⅷ重组蛋白Western blotting和间接免疫荧光验证

从图3可看出,以pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒(试验组)和pEF1α-HA空质粒(对照组)转染LMH细胞,pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒转染细胞裂解出来的蛋白与鼠源HA标记单克隆抗体产生特异性反应,在34 kD处有一特异条带,而对照组在此处未出现相应条带。pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒转染的LMH细胞可观察到大量绿色荧光,而对照组无绿色荧光(图4)。说明Ⅷ重组蛋白在LMH细胞中正确表达。

M: 蛋白 Marker(11～180 kD);1: pEF1α-HA空质粒;2:pEF1α-HA-Ⅷ质粒。M: Protein Marker(11-180 kD);1: pEF1α-HA empty plasmid;2:pEF1α-HA-Ⅷ plasmid.图3 Ⅷ重组蛋白Western blotting验证Fig.3 Western blotting identification of recombinant protein Ⅷ

A: pEF1α-HA空质粒B: pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒。A:pEF1α-HA empty plasmid;B:pEF1α-HA-Ⅷ recombinant plasmid.图4 Ⅷ重组蛋白的间接免疫荧光验证(100×)Fig.4 Indirect immunoflurescence identification of recombinant protein Ⅷ(100×)

2.4 Ⅷ重组蛋白对LMH细胞天然免疫基因表达的影响

与对照组相比,pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒转染后,模式受体STING和MDA5基因的mRNA表达水平上调,其中,STING基因的相对表达量较对照组显著提高了5.6倍(P<0.05,下同),MDA5基因的相对表达量较对照组提高了30%;pⅧ促进接头蛋白TBK1和MAVS的mRNA水平表达,表现为,MAVS基因相对表达量上调倍数较大,较对照组显著提高2.4 倍,TBK1基因相对表达量较对照组显著提高1.5倍;pⅧ促进转录因子IRF7的mRNA水平表达,较对照组显著提高3.4倍,而NF-κB的mRNA水平表达与对照组相比下调2%(图5)。

各模式受体、接头蛋白和转录因子图柱上*表示差异显著(P<0.05)。* on the column of pattern recognition receptors,adaptor proteins and transcription factors indicated significant differences(P<0.05).图5 Ⅷ重组蛋白对模式受体、接头蛋白、转录因子相对表达量的影响Fig.5 Effect of recombinant protein Ⅷ on the relative expressions of the pattern recognition receptors,adaptor proteins and transcription factors

与对照组相比,pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒转染后,干扰素(IFN-α和IFN-β)和白介素(IL-6、IL-8、IL-1β、IL-15)的mRNA水平呈上调表达,其中IFN-α和IFN-β的相对表达量分别极显著高于对照组19.2和14.4倍(P<0.01);白介素中IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β的相对表达量分别显著高于对照组4.1、2.1、6.0和7.9倍(图6)。说明FAdV-4 pⅧ对激活宿主天然免疫通路具有积极作用。

细胞因子图柱上*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。* on the column of cytokines indicated significant differences(P<0.05), ** indicated extremely significant differences (P<0.01).图6 Ⅷ重组蛋白对细胞因子相对表达量的影响Fig.6 Effect of recombinant protein Ⅷ on the relative expressions of cytokines

3 讨 论

FAdV-4感染过程中,FAdV-4编码蛋白发挥着不同作用。Gao等[22]研究发现,hexon蛋白与T复合物多肽1亚单位(CCT7)结合可抑制病毒复制;Medina-Kauwe等[23]研究表明,peton蛋白中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸基序(RGD)与整合素结合,介导病毒进入细胞,并刺激宿主产生保护抗体;Bewley等[24]研究显示,fiber1与细胞受体(CAR)结合,介导FAdV-4 感染宿主并促进病毒表达;Zhao等[25]研究证实,pX蛋白是诱导肝细胞坏死的主要因子;Wang等[26]研究发现,100K蛋白与宿主的热休克蛋白作用能促进病毒复制。目前,关于FAdV-4-Ⅷ基因的功能研究较少。因此,本研究从天然免疫的视角分析FAdV-4 pⅧ和宿主间的相互作用,以此探讨pⅧ在FAdV-4感染和致病过程中的作用和意义。

本研究在LMH细胞中过表达 pⅧ,检测12种重要的天然免疫因子,结果显示所有的免疫因子均发生一定程度的变化,其中一些细胞因子转录水平显著上调表达,说明Ⅷ重组蛋白在LMH细胞中表达,对天然免疫信号通路激活发挥一定作用;模式受体STING和MDA5基因呈上调表达,提示这2个受体在FAdV-4调控天然免疫中发挥重要作用。值得注意的是,二者上调表达的幅度并不一致,说明在Ⅷ重组蛋白进入LMH细胞后,对模式受体的选择存在偏好性。同时猜测Ⅷ重组蛋白作为病毒编码蛋白具有一定的病原相关特征被模式识别受体识别,与加入的FADV-4 病毒竞争结合识别受体。

接头蛋白在病毒感染诱导宿主反应起关键作用,接头蛋白分子一旦被激活,将招募下游的信号激酶复合物,进而磷酸化或激活IRF7和NF-κB等通路,诱导细胞因子产生[27]。在本研究中,TBK1和MAVS基因的表达水平在pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒转染LMH细胞后较稳定;转录因子IRF7和NF-κB的表达量变化有所不同,IRF7基因呈上调表达,而NF-κB基因表达量有所下调,推测Ⅷ蛋白抑制由NF-κB转录因子介导的信号通路。已有研究报道,FAdV-1的Gam-1通过NF-κB转录因子信号通路抑制由TNF-α诱导的Dark细胞凋亡[28],马立克氏病毒编码的RLORF4蛋白与NF-κB蛋白的Rel结构域结合,阻止马立克氏病毒入核;HADV-5的早期蛋白E1A与NF-κB结合抑制TNF-α诱导细胞凋亡[29]。因此推测,FAdV-4后期能利用Ⅷ蛋白抑制NF-κB通路来逃逸宿主的天然免疫。

本研究结果表明,在LMH细胞中过表达Ⅷ蛋白能促进IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β等基因的表达,IFN-α、IFN-β、IL-6和IL-8基因的表达趋势与FAdV-4全病毒诱导的上调结果相似,但这些因子上调幅度低于FAdV-4全病毒诱导,可能与FAdV-4编码多个蛋白及多个蛋白协同作用诱导宿主产生免疫应答有关,而单个Ⅷ蛋白转染细胞产生的免疫应答能力有限,与Zhao等[30]对FAdV-4感染鸡后在脾脏和肝脏中的检测结果一致。已有研究证实,IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、IL-1β和IL-15等细胞因子与免疫反应的激活有关[31-32],可能作为抗病毒反应的主要成分发挥抗病毒感染作用[32-33],表明Ⅷ蛋白在FAdV-4调控宿主的天然免疫应答过程中发挥了重要作用。本研究中,IL-1β和IL-15呈上调表达,与FAdV-4全病毒感染LMH细胞后抑制表达相反,究其原因可能是全病毒毒性太强,炎症因子表达量下调来降低对宿主的损伤,与炎性因子大量表达导致死亡[34]的结果一致。

4 结 论

在LMH细胞中过表达FAdV-4 pⅧ,STING、MDA5、TBK1、MAVS、IRF7、IFN-α、INF-β、IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β等天然免疫相关基因呈上调表达,表明Ⅷ蛋白对FAdV-4激发宿主的天然免疫具有一定促进作用。