李晓川,王朝海,周 平,马 维,陈 军,陆 燚,吴 显,王宗明,吴 瑞,宋治豪,马 杰,付 毅

(毕节市农业科学研究所,贵州 毕节 551700)

【研究意义】马铃薯晚疫病是由致病疫霉菌[Phytophthorainfestans(Mont.)de Bary]引起的世界范围内一大病害[1]。贵州乌蒙山区由于气候冷凉潮湿,特别适合疫霉菌生长,极易造成马铃薯晚疫病的爆发。马铃薯抗性育种对防治晚疫病的发生具有实际意义,而从优异抗病材料中筛选优良晚疫病抗性基因是开展马铃薯抗性育种的重要基础。【前人研究进展】已克隆的晚疫病抗病基因多属于cc-NBS-LRR(coiled-coil、Nucleotide-BindingSite、Leucine-Rich-Repeat)类,因此可利用cc-NBS-LRR类抗病基因的保守一致性序列,筛选晚疫病抗性基因[2-14]。最初晚疫病抗性基因的克隆主要通过图位克隆方式进行,现利用更多的技术手段,从抗晚疫病种质资源基因组或转录组内富集并挖掘包含cc-NBS-LRR保守序列的基因,进而筛选、鉴定晚疫病抗性基因[12-14]。转录组测序技术可以高效地进行差异表达基因的筛选,是现代分子遗传学研究的有效手段[15]。虽然马铃薯晩疫病抗病基因能赋予植株的抗病性,但单个R基因导入马铃薯栽培种所获得的抗性很容易被变异的致病疫霉菌克服,如将RD基因导入而育成的栽培种‘Biogold’,在田间种植不到1年即被晚疫病菌克服[16],而引入多个R基因能增强晚疫病抗病表现[17]。因此,通过利用晚疫病抗性种质,筛选出新的晩疫病抗病基因,将有助于马铃薯晚疫病的抗性育种。【本研究切入点】利用田间3年6点鉴定得到的晚疫病抗性种质,通过转录组测序筛选晚疫病抗/感材料间差异表达基因,基于已知晚疫病抗病基因的一致保守性结构序列,鉴定差异表达基因中的马铃薯晚疫病抗病基因。【拟解决的关键问题】利用晚疫病抗性种质资源,通过转录组测序技术分析差异表达基因和利用保守结构筛选潜在的晚疫病抗性基因,为马铃薯晚疫病抗性种质创新与新品种选育提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试各马铃薯品种/系共23份,均为毕节市农业科学研究所收集并提供。其中,具有持续且较强抗马铃薯晚疫病的品种/品系共20个,分别为11-39-288、11-36-43、10-72-278、11-20-43、14-20-25、13-25-6、14-80-32、14-101-92、189-11-27、24-2-74、22-69-90、19-75-22、24-79-59、16-81-19、合作88、会薯15号、丽薯6号、会薯16号、云薯401和定薯5号;易感晚疫病马铃薯品种3个,分别为卡它丁(Katahdin)、底西瑞(Desiree)和大西洋(Atlantic);各品种均为前期研究从890份马铃薯品种/品系中筛选而得[18]。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 于2020年,在我国马铃薯主产区同时也是晚疫病重发病区的贵州省毕节市七星关区及威宁县选取6个试验点(贵州省威宁县草海镇的郑家营村和卯关村,雪山镇的团岗村、安家营村和法地村,毕节市七星关区朱昌镇王家冲村)进行马铃薯各品种/系的多点种植。每个品种(系)种植50株,种植过程不喷洒晚疫病防治药剂,田间管理按当地常规。在晚疫病大规模发病的早期、中期和晚期各品种/系分别取经晚疫病侵染的大小相似叶片各5片,叶片样品混合后经液氮速冻保存作相关测定分析备用。

1.2.2 转录组测序及分析 叶片样品转录组文库构建和测序送安诺优达生物科技公司进行。经 Illumina NovaSeq PE150高通量平台进行转录组测序,原始数据过滤掉低质量Reads(测序片段)和不合格序列后,完整 Reads 使用Bowtie2与马铃薯参考基因组(SolTub_3.0)进行比对。基于上述比对结果,对各个样本中比对到参考基因组的各unigene(条非重复序列)上的Reads进行定量,并进行FPKM(Fragments per kilobase of exon model per million mapped reads)值的转换,从而获取各条unigene的表达水平[19-20]。利用corrplot软件进行相关性分析。基于定量得到的各unigene的FPKM值进行样品间差异基因比较,利用DEGSeq进行基因差异表达分析[21],并选取|log2Ratio|≥1(即基因间表达水平相差2倍)和q<0.05的基因作为显著差异表达基因,选取基因间表达水平相差10倍和q<0.05的基因作为极显著差异表达基因,成对对比不同晚疫病抗性种质间的差异表达基因(共比对60组),并分析在各组间有共性的差异表达基因。对获得的显著差异表达基因利用基因本体论分析(Gene Ontology)数据库进行基因功能注释[22]。

1.2.3 荧光定量RT-qPCR分析 为验证RNA-seq数据的可靠性,随机挑选7个差异表达基因,在晚疫病抗性种质和晚疫病感病种质之间进行实时定量RT-qPCR表达量验证。利用引物设计软件Primer Premier 5设计引物(表1),内参使用基因EIF-3e,3次重复,使用2-ΔΔCt相对定量法定量计算相对表达量。

表1 RT-qPCR 引物Table 1 Primers of RT-qPCR

1.2.4 序列比对及系统进化分析 基因的氨基酸序列利用Clustal Omega在线服务器(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)进行多序列比对[23]。进化树利用MEGA6软件的Neighbor-Joining参数进行计算1000次生成树图[24]。蛋白结构域利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)[25]和HMMER(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/)在线服务器[26]进行分析。

2 结果与分析

2.1 转录组测序

将23个马铃薯品种/系样本进行转录组测序,过滤低质量Reads和不合格序列后,每个样品测得53 829 328～62 919 076个Reads。将完整Reads与马铃薯参考基因组进行比对,分别有10 229 784～41 585 344个Reads比对到参考基因组上。对各个样本中比对到参考基因组unigene上的Reads进行定量,并进行FPKM值转换,获取各条unigene的表达水平。对23个样本间各基因的表达水平进行相关性检验结果(表2)显示,A3(10-72-278)、B4(14-80-32)、C5(16-81-19)以及3个易感晚疫病马铃薯品种N3(卡它丁)、N4(底西瑞)、N5(大西洋)的表达模式整体上和其余材料的表达模式有一定区别。A3、B4、C5与N3、N4、N5间表达模式的相关性系数平均为0.68;与其余抗性材料间的相关性系数平均为0.74;其余抗性材料与N3、N4、N5间的相关性系数平均为0.75;其余抗性材料间的相关系数平均为0.87。说明,晚疫病抗/感材料间病叶内的基因表达模式存在一定差异。利用RT-qPCR对转录组测序表达量进行验证显示,RT-qPCR和RNA-seq测得的基因表达量基本一致(图1),说明研究的转录组测序得到的基因表达数据可靠,可进行下一步差异基因表达分析。

图1 差异基因表达的RT-qPCR验证Fig.1 Validation of differentially expressed genes by RT-qPCR

表2 23个马铃薯品种/系样本的表达模式相关性系数(r)Table 2 The correlation coefficient of expression levels of the 23 potato varieties(lines)

2.2 差异表达基因

经对60组不同晚疫病抗感单个品种的转录组比对,有6034个基因表达水平显著上调,4611个基因表达水平显著下调。对显著差异性表达基因从生物过程(Biological process)、分子功能(Molecular function)和细胞成分(Cellular component)3个类别利用GO数据库进行基因功能注释,其中5275个表达显著上调的基因和4109个表达显著下调的基因拥有GO功能注释。表达显著上调的4626个基因拥有生物过程类别的功能注释,4745个基因拥有分子功能类别的功能注释,4704个基因拥有细胞成分类别的功能注释(图2)。表达显著下调的3617个基因拥有生物过程类别的功能注释,3723个基因拥有分子功能类别的功能注释,3602个基因拥有细胞成分类别的功能注释。根据GO功能富集结果,在表达显著上调基因中,有508个基因的表达产物参与转录调控,1084个基因的表达产物拥有ATP结合功能,1179个基因的表达产物位于细胞核内发挥功能(图3)。

A为显著差异性上升表达基因GO基因功能注释,B为显著差异性下降表达基因GO基因功能注释。A:The GO gene functional annotation of up-expressed genes with significant difference; B: The GO gene functional annotation of down-expressed genes with significant difference.图2 显著差异性上升表达基因GO基因功能注释Fig.2 GO gene functional annotation of up-expressed genes with significant difference

图3 显著差异性下降表达基因GO基因功能注释Fig.3 GO gene functional annotation of down-expressed genes with significant difference

进一步选取样品间基因表达水平相差10倍和q<0.05的基因作为极显著差异表达基因进行分析,有313个基因表达水平极显著上调,111个基因表达水平极显著下调。对极显著差异表达基因利用GO数据库进行基因功能注释,其中表达极显著上调的276个基因拥有生物过程类别的功能注释,282个基因拥有分子功能类别的功能注释,273个基因拥有细胞成分类别的功能注释。其中表达极显著下调的100个基因拥有生物过程类别的功能注释、108个基因拥有分子功能类别的功能注释,93个基因拥有细胞成分类别的功能注释。根据GO功能注释,在表达极显著上调基因中,35个基因的表达产物参与转录调控,78个基因的表达产物拥有ATP结合功能,87个基因的表达产物位于细胞核内发挥功能(图4)。

A为极显著差异性上升表达基因GO基因功能注释,B为极显著差异性下降表达基因GO基因功能注释。A: The GO gene functional annotation of up-expressed genes with extremely significant difference; B: The GO gene functional annotation of down-expressed genes with extremely significant difference.图4 极显著差异性表达基因GO基因功能注释Fig.4 GO gene functional annotation of expressed genes with extremely significant difference

2.3 候选晚疫病抗性基因

在极显著差异表达基因中有3个基因属于cc-NBS-LRR类,分别为PGSC0003DMP400034099、PGSC0003DMP400045185和PGSC0003DMP400042154,其中,PGSC0003DMP400034099基因由876个氨基酸组成,PGSC0003DMP400045185基因由911个氨基酸组成,PGSC0003DMP400042154基因由888个氨基酸组成。将3个基因编码的氨基酸序列与已知马铃薯抗晚疫病基因编码的氨基酸序列进行比对显示,已克隆的R基因和候选R基因的蛋白序列内都含有cc、NBS和LRR结构域区域(图5)。对R基因进行系统进化分析显示,PGSC0003DMP400034099和Rpi-amr3i基因的亲缘关系较近,其间蛋白氨基酸序列同一性为37.87%;PGSC0003DMP400045185和Rpi-amr3i基因的亲缘关系较近,同时又和R1-A、R8以及Rpi-blb2基因的亲缘关系较近,氨基酸序列同一性范围在27.54%～29.92%;PGSC0003DMP400042154和Rpi-vnt1基因的3个转录本亲缘关系较近,翻译的蛋白序列同一性范围在80.05%～80.16%(图6)。已克隆的R基因所翻译的蛋白,序列同一性最小的是Rpi-blb1/RB和R8间,为21.67%;除同一基因不同转录本翻译成的蛋白和不同马铃薯野生种间的同源基因翻译成的蛋白外,已克隆的R基因序列同一性最大的是Rpi-blb2和R8间,为33.53%。进一步分析筛选的3个R基因翻译的蛋白内部结构域,在蛋白PGSC0003DMP400034099内有9个LRR结构域,而蛋白Rpi-amr3i内只有4个。PGSC0003DMP4000451 85内部有比Rpi-amr3i、R1-A、R8和Rpi-blb2更多的LRR结构域,共9个,且包含MeaB和Hc1结构域。蛋白PGSC0003DMP400042 154和Rpi-vnt1序列内部均含有一个ABC 转运体结构域,但PGSC0003DMP400042154内部有3个LRR结构域,而3个Rpi-vnt1只有1个LRR结构域。

类似性质的氨基酸为同颜色字符;黄色为R基因的cc结构域区域,蓝色为NBS结构域区域,灰色为LRR结构域区。Amino acids with similar features in the figure are in the same color; The regions of cc domains in R genes are marked in yellow, the regions of NBS domains are marked in blue, and the LRR domains are marked in gray.图5 3个晚疫病抗性基因的氨基酸与已克隆的晚疫病抗性基因的的氨基酸序列比对Fig.5 Comparison between amino acid sequence of protein from 3 resistance genes to late blight and protein from cloned resistance genes to late blight

分支上的值表示自展值(>50%)。图下方的标记表示长度为0.1的枝长。Values above the branches represent bootstrap support values (>50%). The bar in the downside represent the branch length of 0.1.图6 3个晚疫病抗性候选基因与已克隆的晚疫病抗性基因的系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree of 3 candidate resistance genes to late blight and cloned resistance genes to late blight

3 讨 论

转录组测序分析在马铃薯抗晚疫病机制研究中应用广泛,特别是寄主—病原间互作的信号传导通路的研究,在马铃薯对晚疫病原菌的过敏性反应中涉及了水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)介导的多信号通路的基因[27]。过敏性反应(非亲和互作)可能是植株与块茎对致病疫霉菌抗性的一种普遍表现形式,诱导了大量基因的表达[28]。晚疫病菌对马铃薯种质在侵染早期非亲和互作的差异表达基因数比亲和互作多,在侵染晚期则正好相反[29]。在亲和互作与非亲和互作中,一半有差异丰度的蛋白质在转录水平上显示出相应的变化[30]。本研究中,在抗/感病种质间分别有6034和4611个基因有表达水平相差2倍的上调或下调,在表达上调的基因中,有508个基因的表达产物参与转录调控,1084个基因的表达产物拥有ATP结合功能,1179个基因的表达产物位于细胞核内发挥功能。另外,分别有313和111个基因表达量相差10倍上调或下调。并且相关性分析显示总体上晚疫病抗性、感性材料间染病叶片内的基因表达模式存在一定差异。

植物的抗病基因R能够被特异的效应子识别,导致非亲和互作发生,目前马铃薯的晚疫病抗病基因已被克隆出多个,其如同植物抗病基因一样都是cc-NBS-LRR类基因,是马铃薯抗病育种的重要内容和分子标记辅助抗病育种的主要位点[2-14]。本研究表明,在表达水平相差10倍的基因中,有3个cc-NBS-LRR类基因,与之前发现的马铃薯晚疫病抗病基因不同。其中PGSC0003DMP400034099和Rpi-amr3i亲缘关系较近,两者间蛋白氨基酸序列同一性为37.87%,Rpi-amr3i克隆自马铃薯野生种Solanumamericanum[14]。PGSC0003DMP400045185和Rpi-amr3i、R1-A、R8以及Rpi-blb2基因的亲缘关系较近,氨基酸序列同一性范围在27.54%～29.92%。Rpi-blb2基因具有广谱晚疫病抗性,克隆自马铃薯野生种Solanumbulbocastanum[9]。PGSC0003DMP400042154和3个Rpi-vnt1基因的3个转录本的亲缘关系较近,翻译的蛋白序列同一性范围在80.05%～80.16%。Rpi-vnt1.1克隆自具有广谱晚疫病抗性的马铃薯野生种Solanumventurii基因,与马铃薯野生种Solanumphureja的Rpi-phu1基因同源[11,13]。进一步分析3个cc-NBS-LRR类基因编码的蛋白质结构域发现,其与近缘R基因表达产物有不同数量的LRR结构域。LRR结构域存在于很多功能蛋白质中,推测与蛋白质之间的互作有关,部分R基因产物的LRR结构域直接与病菌的效应子互作[31]。

植物和病原菌的互作是个非常复杂的过程[27],转录组测序可以提供大量基因的表达信息[15],有助于更好地了解植物与病原菌互作的机理。对于马铃薯晚疫病抗性育种来说,从众多可能影响植物和病原菌的互作的基因中,筛选出新的晩疫病抗病基因,并开发出相关分子标记,将有助于马铃薯晚疫病抗性育种。

4 结 论

在马铃薯抗、感病种质间的差异表达中筛选到大量差异表达的基因,其中显著上调表达的cc-NBS-LRR类基因PGSC0003DMP400034099、PGSC0003-DMP400045185和PGSC0003DMP400042154与已知晚疫病抗性功能基因的具有相同的保守性分子结构,但氨基酸组成序列不同,这些基因在抗性品系中高表达,在易感品系中低表达,可能参与马铃薯持续强抗晚疫病。