李维钊,申甚莉,边阳萍,赵婉均,汪 夏,殷 菲

(1.重庆理工大学 药物化学与分子药理学重庆市重点实验室, 重庆 400054; 2.重庆理工大学 药学与生物工程学院, 重庆 400054)

0 引言

2型糖尿病的主要特征是持续高血糖和胰岛素抵抗,维持血糖水平对2型糖尿病的防治至关重要。在哺乳动物细胞中,葡萄糖的转运由葡萄糖转运蛋白 (glucose transporter,GLUT)介导,GLUT的分布和功能在不同组织中存在很大差异。GLUT2是GLUT的家族成员,主要在胰岛β细胞、肝、肾、脑和肠中表达[1]。GLUT2作为一种糖基化蛋白,是啮齿动物胰腺β细胞中的主要葡萄糖转运蛋白,也是葡萄糖吸收所必需的转运蛋白。GLUT2可以感受细胞外微环境变化,使细胞内、外的葡萄糖水平达到快速平衡[2]。在糖尿病动物模型中,GLUT2表达的下调常伴随着葡萄糖诱导胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion,GSIS) 障碍[3-4],但是,在胰岛β细胞中通过转基因重新表达GLUT2可以恢复GLUT2缺失小鼠胰岛素分泌能力[5]。这表明,胰岛β细胞表面的GLUT2可通过调节GSIS在维持饮食摄入所致血糖动态平衡中起关键作用。

已有大量研究结果证实,糖基转移酶家族在细胞内蛋白的反应后修饰过程中起重要作用,其中糖基转移酶III (glycosyltransferase III,GnT-III)和GnT-V与多种癌症的发生、发展密切相关[6]。GnT-IV可以通过催化GlcNAc残基将其转移到N-糖链核心的α-1,3甘露糖上,形成β-1,4分支结构[7]。虽然GnT-IVa和GnT-IVb都属于糖基转移酶IV,是一对同工酶,但GnT-IVa比GnT-IVb具有更高的亲和力,在组织中的表达更具特异性[8]。数据库PhosphoSitePlus分析结果显示,GnT-IVa在胰腺中高度表达,且与2型糖尿病的发生和发展密切相关。已有研究报道,当小鼠GnT-IVa受损时,会导致高血糖症、葡萄糖耐量异常和胰岛素分泌不足。进一步研究发现,这是由胰腺β细胞关键葡萄糖转运蛋白GLUT2的功能障碍引起的。GLUT2的N-聚糖被GnT-IVa修饰后,可通过促进GLUT2与半乳凝集素形成分支结构,提高GLUT2在细胞膜上的驻留时间,促进葡萄糖吸收,降低血糖。在高脂饮食喂养的小鼠中,由于高脂食物诱导GnT-IVa的关键转录因子叉头蛋白A2 (Forkhead Box A2,FOXA2)表达异常,导致GnT-IVa表达下调,进而影响GLUT2的糖基化和在细胞膜上的分布,并最终影响葡萄糖的吸收和代谢。与此同时,通过对2型糖尿病患者的检测发现,GnT-IVa的表达显著降低[9-10]。这些研究结果表明,GnT-IVa在葡萄糖吸收、代谢和2型糖尿病的形成发展过程中可能具有十分重要的作用。

通过已有研究发现:在原代大鼠胰岛β细胞和INS-1大鼠胰岛β细胞中,京尼平苷可以快速促进低、中糖 (5 mmol/L和11 mmol/L)培养条件下的胰岛β细胞对葡萄糖的吸收、代谢和葡萄糖诱导胰岛素分泌;然而,在高糖(25 mmol/L)培养条件下,京尼平苷发挥相反的作用,不仅抑制葡萄糖的吸收和代谢,还减少胰岛素分泌[11-15]。最近的研究证实,京尼平苷可快速调节GLUT2糖基化和蛋白糖基化关键分子GlcNAcT-IVa糖基化转移酶 (GlcNAcT- IVa glycosyl-transferase,GnT-IVa)表达。但是,GnT-IVa是否与京尼平苷调节GLUT2糖基化、胰腺β细胞对葡萄糖的吸收、代谢和GSIS有直接联系,还需进一步研究。

首先用siRNA干扰的方法敲低INS-1细胞中GnT-IVa基因表达水平,然后考察京尼平苷对干扰后INS-1细胞中GLUT2糖基化、葡萄糖吸收、代谢和胰岛素分泌的调节作用,以确定京尼平苷的调节作用是否与GnT-IVa有关。实验结果表明:GnT-IVa基因干扰后,京尼平苷对GLUT2糖基化的调节作用减弱,GLUT2在细胞膜上的分布减少,且对胰腺β细胞葡萄糖吸收、ATP生成和GSIS产生了影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

京尼平苷粉末购自中国食品药品检定研究院;PIMR细胞基础培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司;GnT-IVa抗体购自Cell Signaling Technology公司;GLUT2抗体购自Proteintech Group公司;Opti-MEM 购自Invitrogen公司;β-actin抗体山羊抗小鼠IgG (H+L)、山羊抗兔IgG (H+L)购自中杉金桥;BCA蛋白定量测定试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;ECL发光液购自新赛美生物技术公司;EndoFectinTM-Max转染试剂购自GeneCopeoia公司;葡萄糖检测试剂盒购自士锋生物有限公司;胞浆胞膜分离提取试剂盒、ATP检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司;大鼠胰岛素检测试剂盒购自伊艾博(武汉)科技有限公司;酶标仪购自Tecan公司;倒置显微镜购自日本尼康公司;GEAI600凝胶成像系统购自美国通用电气公司;电泳仪购自美国Bio-rad公司。

1.2 细胞培养

实验用INS-1细胞购自中国典型细胞培养物保藏中心。其正常培养基为:葡萄糖浓度为11 mmol/L的RPMI1640完全培养基 (含10%的胎牛血清,10 mmol/L HEPES,2 mmol/L L-谷氨酰胺,1 mmol/L丙酮酸钠,50 μmol/L的巯基乙醇,100 μg/mL的链霉素和100 U/mL的青霉素),培养条件为37 ℃,在含5% CO2的细胞培养箱中培养。

1.3 GnT-IVa基因干扰

将INS-1细胞接种到6孔板培养过夜,将细胞用PBS漂洗1次,换成无血清培养基,根据供应商的建议将转染试剂Lipofectamine 2000与Mgat4a (GnT-IVa编码基因)的siRNA按比例混合后,静置15 min,加入到细胞培养基中,继续培养48 h,用蛋白免疫印迹检测基因干扰效率。

GnT-IVa (编码基因为Mgat4a)的siRNAs核苷酸序列如下:

siGnT-IVa-1:CUUACCCUGUCCUGGUAU; siGnT-IVa-2:GCUCAGGAGAAGGGC AUUU; siGnT-IVa-3:CCUUUCGACUG UCGGUUAG; 随机序列(Scrambled sequence siRNA,NC):CAGUGUCAUA CGUACGACG。

1.4 细胞膜蛋白分离

将GnT-IVa基因干扰和对照组INS-1细胞消化、接种到6孔板,孵育过夜,用PBS漂洗1次,将培养基更换为葡萄糖浓度分别为5、11和25 mmol/L的完全培养基,加入终浓度为10 μmol/L京尼平苷继续培养1 h。收集细胞,参照碧云天细胞膜和细胞浆蛋白分离试剂盒说明书要求分离细胞膜蛋白。大致实验步骤如下:

用蛋白提取剂A在冰浴中孵育10～15 min,匀浆30～50次后,将细胞裂解液在4 ℃、700×g下离心10 min,去除细胞核和未碎裂的细胞,于冷冻离心机4 ℃、14 000×g离心30 min,上清液即为细胞浆蛋白;向沉淀中加入200 μL膜蛋白提取剂B,以最大涡流速度重新悬浮10 s,冰浴15 min。裂解产物在4 ℃、14 000×g,离心5 min,收集上清液即为细胞膜蛋白。

1.5 蛋白免疫印迹分析

将各种分离的蛋白经BCA法定量后,取20～30 μg蛋白上样,经10% SDS-PAGE电泳后转移到PVDF膜上,室温下用封闭液 (5%脱脂奶粉)封闭2 h。用1∶2 000稀释的GnT-IVa或GLUT2抗体在4 ℃孵育过夜,用TBST (20 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,2.7 mmol/L KCl,0.1% 吐温20,pH值7.4)漂洗3次,每次10 min,洗去未结合的一抗;然后,用1∶10 000稀释的辣根过氧化物酶 (HRP)标记的二抗孵育1 h,用TBST洗去未结合的二抗;最后,用ECL Western blotting试剂显影、成像,用Image J软件进行条带的密度分析。

1.6 葡萄糖摄取、ATP和胰岛素含量测定

将GnT-IVa基因干扰和对照组INS-1细胞接种到6孔板,培养过夜。用KRBB缓冲溶液(129 mmol/L NaCl,4.8 mmol/L KCl,1.2 mmol/LMgSO4,1.2 mmol/L KH2PO4,2.5 mmol/L CaCl2,5 mmol/L NaHCO3,0.1% BSA,10 mmol/L HEPES,pH值7.4)漂洗1次,换成新鲜的KRBB饥饿2 h,随后加入京尼平苷 (终浓度为10 μmol/L)继续培养1 h。分别收集培养基上清液、全细胞裂解物,用商业化的葡萄糖、ATP和胰岛素检测试剂盒按照说明书的步骤测定上清液中葡萄糖和胰岛素含量,以及全细胞裂解液中ATP的含量。

1.7 数据统计分析

实验数据均采用Origin 8.0软件进行单因素方差统计分析,所有实验均重复至少3次,结果以平均值±标准偏差表示。组间比较以p<0.05表示有显著差异。

2 实验结果

2.1 GnT-IVa siRNA干扰效率分析

为明确GnT-IVa基因在京尼平苷调节GLUT2糖基化和在细胞膜上分布的影响,拟用siRNA干扰的方法敲低INS-1细胞中GnT-IVa基因表达水平。因此,首先对siRNA的转染效率和干扰效率进行比较。实验结果表明,当转染浓度为50 nmol/L时,siRNA的转染效率可达到90%左右,见图1(a)和(b)。随后,用50 nmol/L的siGnT-IVa转染细胞继续培养48 h,蛋白免疫印迹的结果证实,siRNA3的干扰效率明显高于siRNA1和siRNA2。50 nmol/L siRNA3 转染48 h后,GnT-IVa的蛋白水平降低了约70% ,见图1(c)。图1(c)中,NC表示随机序列,数据显示为平均值±标准差(n=3)。

图1 siRNA对INS-1细胞GnT-IVa基因的转染及干扰效率

2.2 京尼平苷对GnT-IVa干扰的INS-1细胞中GLUT2蛋白糖基化水平的影响

在GnT-IVa干扰的INS-1细胞中考察京尼平苷对糖基化的GLUT2蛋白水平的影响。实验结果表明,在GnT-IVa干扰的INS-1细胞中,京尼平苷对GLUT2蛋白糖基化没有明显影响 (图2),提示GnT-IVa在京尼平苷调节INS-1细胞中GLUT2糖基化过程中可能有重要作用。

NC:随机序列; siRNA:siGnT-IVa-3; siRNA+Gen:siGnT-IVa-3+京尼平苷。数据代表平均值±标准差 (n=3)。

2.3 京尼平苷对GnT-IVa干扰的INS-1细胞中GLUT2在细胞膜上分布的影响

通过已有研究发现,在中(11 mmol/L)、低(5 mmol/L)浓度葡萄糖条件下,京尼平苷可快速促进糖基化的GLUT2从细胞浆向细胞膜转运,提高胰腺β细胞对葡萄糖的吸收和代谢能力,促进胰岛素分泌,但在高糖(25 mmol/L)条件下,京尼平苷发挥完全相反的作用。本文中,采用蛋白免疫印迹的方法在GnT-IVa干扰的INS-1细胞中考察京尼平苷在不同浓度葡萄糖条件下对GLUT2在细胞膜上分布的影响。实验结果证实,在GnT-IVa干扰的INS-1细胞中,京尼平苷对GLUT2在细胞膜上的分布没有明显影响。这一结果提示,京尼平苷调节GLUT2在细胞膜上的分布可能与GnT-IVa蛋白有一定的关系 (图3)。

5:5 mmol/L葡萄糖;5+Gen:5 mmol/L葡萄糖+10 mmol/L京尼平苷;11:11 mmol/L葡萄糖;11+Gen:11 mmol/L葡萄糖+10 mmol/L京尼平苷;25:25 mmol/L葡萄糖;25+Gen:25 mmol/L葡萄糖+10 mmol/L京尼平苷。(图4同)。数据代表平均值±标准差 (n=3)。

2.4 京尼平苷对GnT-IVa干扰后的INS-1细胞葡萄糖吸收、代谢和胰岛素分泌的影响

为进一步明确GnT-IVa在京尼平苷调节胰腺β细胞葡萄糖吸收、代谢和糖促胰岛素分泌中的作用,在GnT-IVa基因干扰的INS-1细胞中考察京尼平苷对葡萄糖吸收、ATP生成和GSIS的影响。实验结果表明,对照组细胞中,在中 (11 mmol/L)、低 (5 mmol/L)葡萄糖浓度下,京尼平苷可明显促进葡萄糖吸收,增强ATP生成,提高GSIS;在高糖 (25 mmol/L)条件下,京尼平苷发挥完全相反的作用,不仅抑制葡萄糖吸收,减少ATP生成,而且抑制GSIS。但在GnT-IVa干扰后,京尼平苷的这些作用被明显抑制,在高糖和中低浓度葡萄糖条件下,京尼平苷对INS-1细胞的葡萄糖吸收、代谢和GSIS都没有明显的影响 (图4)。

A:葡萄糖摄取;B:ATP生成;C:GSIS。数据为平均值±标准差 (n=6)。* p<0.05 vs.单独使用5 mmol/L葡萄糖;# p<0.05 vs.单独使用11 mmol/L葡萄糖;& p<0.05和&& p<0.01 vs.单独使用25 mmol/L葡萄糖。

3 结束语

GnT-IVa是糖基转移酶家族 (GnTs)的一员,主要功能是在N-糖链的五碳糖核心上催化添加β-1,4糖链,广泛存在于细胞内的高尔基体和内质网催化细胞内如蛋白质、脂类和核酸等其他分子糖基化,使其具有正常生物学功能[6,16]。多年来,GnT-IVa在癌细胞增殖机制中得到广泛研究,但其在2型糖尿病防治研究方面的报道还很少见。近来,研究逐渐发现,GnT-IVa在胰腺β细胞中高度表达,其很可能参与了2型糖尿病的发生和发展。GnT-IVa缺陷小鼠表现出高血糖症,胰岛素水平和糖耐量异常等现象。经进一步探索发现,GnT-IVa缺陷与GLUT2蛋白功能障碍密切相关[17]。在GnT-IVa无活性的胰腺β细胞中,GLUT2通过内吞作用被内化,导致其功能受损。

通过siRNA干扰的方法考察了GnT-IVa与京尼平苷调节胰腺β细胞GLUT2糖基化、葡萄糖吸收、代谢和胰岛素分泌的相关性。研究结果表明,在GnT-IVa干扰的INS-1细胞中,京尼平苷对GLUT2的糖基化水平影响被明显抑制;在不同糖浓度条件下,京尼平苷对胰腺β细胞葡萄糖吸收、ATP生成和胰岛素分泌的调节作用也被明显抑制。提示GnT-IVa在京尼平苷调节胰腺β细胞GLUT2糖基化、葡萄糖吸收、代谢和GSIS过程中具有重要作用。

栀子是一种药食两用植物,史载于《神农本草经》,具有清热利湿、泻火除烦、凉血解毒、消肿止痛等功效,还有抗哮喘、急性胰腺炎、胃炎、降血糖、抗氧化和抗肿瘤等药理作用[18-19]。近年来,栀子及其主要活性成分京尼平苷对慢性代谢疾病的影响受到广泛关注。京尼平苷能增加胰腺β细胞内细胞色素P450 (cytochrome P450)的含量,增强细胞对炎症的抵抗能力,维持胰腺组织的正常供血,有效改善胰腺炎的预后修复[20]。通过激活PPARγ受体增强下游基因对胰岛素的响应程度,京尼平苷可以减轻胰岛β细胞补偿性分泌胰岛素的负荷,减缓胰岛β细胞的凋亡,从而阻止2型糖尿病的发生和发展[21-22]。同时,京尼平苷具有降低肾上腺素所致高血糖、地塞米松致胰岛素抵抗高血糖和四氧嘧啶致糖尿病高血糖的作用[23]。

本课题组通过高通量筛选发现,京尼平苷是胰高血糖素样肽-1 (glucagons-like peptidel-1,GLP-1)受体的选择性激动剂,可通过激活GLP-1受体发挥神经营养和神经保护功能[24-25]。通过激活GLP-1受体,京尼平苷能够显著调节INS-1和原代大鼠胰岛β细胞胰岛素分泌[13,15,26,27]。此外,京尼平苷还可以通过促进胰岛淀粉样多肽的降解,拮抗其诱导的β细胞的损伤和凋亡[11,28],抑制高糖、高脂条件下β细胞的氧化应激、非折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)和炎症因子等诱导的β细胞凋亡[29-30]。上述研究结果表明,京尼平苷可能在2型糖尿病的防治中具有广阔应用前景。