陈国宝,董刚立,杨 欢,陈忠敏,王富平

(重庆理工大学 药学与生物工程学院, 重庆 400054)

0 引言

血管疾病是当前威胁人类健康的主要疾病之一[1]。2018年,我国城乡居民因患心血管疾病而造成的死亡居城乡居民总死亡原因的首位。当发生动脉粥样硬化或血管闭塞时可导致组织缺血,因此需要进行血管置换。目前,常见的血管移植物大致可分为自体血管移植、异种血管移植和血管组织工程。自体移植物是临床手术中的黄金标准,但由于反复手术、来源匮乏,不利于患者的后续治疗;异种血管移植生物相容性不佳,不仅存在免疫原性,容易与机体产生排斥反应从而对机体造成损伤,还可能传播疾病造成感染[2],很难满足血管移植的要求。组织工程技术的快速发展为血管疾病的治疗提供了一种新的解决方案,理想的组织工程血管具有一定的降解性,在植入后由宿主细胞重塑,支架的降解速率与组织生长速率相匹配,并具有和天然血管类似的结构和功能。

目前,国内外开发的血管支架主要有金属支架[3-5]、合成高分子支架[6-7]、天然高分子支架[8-10],每类支架材料都有其优缺点,需要多种材料复合实现优势互补。例如,金属类血管支架仍无法有效地控制其在机体内降解的时间,且与机体之间的生物相容性较差,容易增加血栓和内膜增生风险,因此不能大量投入到临床应用[11]。可降解聚合物支架材料与金属类血管支架材料相比,其结构可以根据特定的孔隙率和微观结构而精确制备,进而得到较为理想的支架材料。聚己内酯(polycaprolactone,PCL)具有广泛粘弹性,可以模仿天然组织,但降解速率低于其他材料,且制备得到的支架硬度大,无法较好地满足天然血管的条件。可见,单独用聚合物制备得到的血管支架整体性能不佳,且降解速率不同,进而影响其机械性能[12]。

丝素蛋白、胶原蛋白等天然材料常用于构建血管支架。丝素蛋白具有良好的生物相容性,其化学性能和机械性能也较为稳定,因此在血管支架的制备方面应用非常广泛[13-14]。另外,脱细胞血管也是一种有潜力的支架材料。脱细胞血管去除了细胞成分,保留组织或器官的三维结构和一些天然纤维成分,同时具有生物活性,并保留了许多细胞生长因子。尽管脱细胞血管基质在力学性能、组织相容性等方面表现出色,脱细胞血管基质复合支架体外表征良好,但目前还没有成功的人造小口径血管支架移植试验案例[15]。目前,发展功能性和植入式脱细胞血管移植物面临的挑战主要有同种异体细胞的免疫排斥反应、自体细胞衰老、再细胞化方法的高成本等[16],同时传统的脱细胞支架可能由于密集的细胞外基质网络而具有较低的细胞通透性。最近,有研究表明脱细胞血管基质凝胶(decellularized vascular matrix gel,DVMG)是一种有前景的材料,不仅具有脱细胞血管基质的优点,还可以通过改变水凝胶的浓度或交联密度来控制血管支架的机械性能。此外,DVMG具有适合细胞生长的三维结构,具有可修饰性和可加工性。但单独DVMG力学性能较弱,常需要与高分子材料复合以进一步调整其力学性能与天然血管相匹配。

考虑到PCL力学性能好、降解无毒,而DVMG保留了许多细胞生长因子,生物相容性好,故采用PCL与DVMG复合作为血管修复支架材料,将复合材料浇筑在管状模具上,室温冷却干燥后得到血管支架。制备出一系列不同比例的血管支架,并评估这些支架的微观形貌及结构、力学性能、降解性能;得到与天然血管性能类似的血管支架,从而为心血管疾病的治疗研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

新鲜猪的主动脉、甲醇(成都市科龙化工试剂厂)、无水乙醇(重庆川东化工(集团)有限公司)、冰醋酸(上海麦克林生化科技有限公司)、脱氧核糖核酸酶I (北京Solarbio生物科技有限公司)、胃蛋白酶(北京Solarbio生物科技有限公司)、聚乙二醇辛基苯基醚(北京Solarbio生物科技有限公司)、多聚甲醛(北京Labgic科技有限公司)、二甲苯(成都市科隆化学品有限公司)、中性树胶(中国上海懿洋仪器有限公司)、伊红苏木素染色液(碧云天生物技术有限公司)、基因组DNA小量抽提试剂盒(碧云天生物技术有限公司)、PCL (上海麦克林生化科技有限公司)、磷酸盐缓冲液(Biosharp)、磁力搅拌仪79-1 (常州国华电器有限公司)、电子天平AR1530 (梅特勒-托利多仪器有限公司)、电热鼓风干燥箱101型(北京中兴伟业有限公司)、气浴恒温振荡器THZ-82A (金坛市科析仪器有限公司)、数显恒温水浴锅HH-2型(常州国华电器有限公司)、真空干燥箱DZF (常州衡正电子仪器有限公司(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)、切片机KD3368AM (浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)、粘附载玻片(江苏世泰实验器材有限公司)、力传感器CLY30 (长春机械研究院)、傅里叶变换红外光谱仪(珀金埃尔默股份有限公司)、TGL-16M高速台式冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)。

1.2 DVMG的制备

DVMG制备方法如图1所示。将猪的新鲜血管取出,经过化学和物理的方法脱细胞后得到脱细胞血管,再将其研磨成粉并用胃蛋白酶酶解得到脱细胞血管基质凝胶。屠宰场取得新鲜的猪主动脉后,将其裁剪成小块,加入适量去离子水后,将各离心管放在气浴恒温振荡器中振荡12 h。向清洗后的猪主动脉中加入浓度为3 %的Triton X-100溶液,于气浴恒温振荡器中振荡浸浴12 h。再用甲醇浸没猪的主动脉,置于气浴恒温振荡器中振荡浸浴24 h进行脱脂处理,处理期间需更换甲醇3次。用配置好的DNase I稀释液浸没猪的主动脉,在气浴恒温振荡器中于37 ℃环境下温育猪主动脉4 h后加入适量无水乙醇振荡4 h。用适量去离子水于37 ℃环境下振荡浸浴猪的主动脉2 h,清除残余的酒精。将清洗后的脱细胞猪主动脉置于37 ℃的真空干燥箱内干燥3～4 d研磨成粉保存备用。取200 mg的DVM粉,向其中加入20 mL浓度为1 mg/mL的胃蛋白酶(pepsin)溶液,在37 ℃环境条件下进行搅拌,使DVM粉末酶解成为DVMG保存备用。

图1 DVMG制备方法示意图

1.3 复合血管支架的制备

在60 ℃条件下,用冰醋酸配置60%的PCL溶液。将配置的PCL溶液与DVMG按照DVMG∶PCL为0∶1、1∶1、1.5∶1、5∶1的比例在55 ℃的水浴锅中进行混合,静置消泡。待混合液气泡完全散去后,用自制模具在60 ℃的水浴锅中对不同比例的DVM-PCL混合溶液进行重复包裹,室温冷却脱模,保存备用。

1.4 扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM)观察

将DVMG∶PCL (1∶1)、DVMG∶PCL (1.5∶1)、DVMG∶PCL (5∶1)的血管支架进行喷金处理,在真空条件下使用SEM对血管支架的表面、截面进行SEM不同倍数观察。进行相关分析,观察血管支架是否由于DVMG含量的改变导致支架结构的变化。

1.5 傅里叶红外光谱检测

将Thermo傅立叶红外光谱仪分析仪初始化。在软件中设置测试参数和扫描频率,扫描背景后,向样品仓内放入样品开始扫描图谱。选择纯PCL、DVMG∶PCL (1∶1)、DVMG∶PCL (1.5∶1)、DVMG∶PCL (5∶1)的血管支架作为本次红外光谱分析所需要的材料。

1.6 力学性能测试

准备DVMG∶PCL为0∶1、1∶1、1.5∶1、5∶1的血管支架材料,每组各取3个。打开电脑与机器相联通,在软件中设置待测的形状、测试方式等。将各比例支架均匀裁剪成条状,用刻度尺、螺旋测微仪测量样品的宽度、厚度、长度、标距。一切准备就绪后鼠标点击开始运行测试,支架以5 mm/min拉伸至断裂。支架拉断时结束实验,保存数据并进行处理。

1.7 支架降解能力测定

取相同质量不同配比的DVMG-PCL血管支架(0∶1、1∶1、1.5∶1、5∶1),每组取3个支架样品。每组支架的质量记为M0。取12个离心管,加入适宜的PBS缓冲液,将称重后的各比例的血管支架材料分别置于其中。气浴恒温振荡器中的温度设定为37 ℃,将离心管放入其中振荡浸浴1周,1周后取出支架材料样品,用滤纸吸取支架表面附着的水分,置于37 ℃的烘箱中干燥30 min,再称重,质量记为M1。每隔1周对各组样品进行称重,质量记为Mn(n=1,2,3,4,n为检测时的周数)。各比例血管支架的部分剩余率为Mn/Mn-1。

利用Origin软件画出血管支架的部分剩余率变化曲线,横坐标为降解时间,纵坐标为降解每周后的剩余率(部分剩余率)。各比例血管支架的总剩余率为Mn/M0。

1.8 H&E染色

新鲜猪主动脉与经脱细胞处理后的猪的主动脉各取3组,用4%多聚甲醛固定24 h,然后用PBS溶液充分清洗固定后的组织,以除去残留的固定液。利用不同浓度的酒精对固定新鲜猪主动脉和脱细胞猪主动脉组织分别进行脱水处理,每次处理时间为1 h。脱水过程中,需用100%酒精对组织脱水2次。放入二甲苯溶液中进行2次透明处理,每次20 min。将石蜡于60～70 ℃下熔化,将透明后的新鲜猪主动脉以及脱细胞猪主动脉组织块置于60 ℃的真空干燥箱中2 h进行透蜡处理,冷却过夜。包埋组织的石蜡块经修剪后进行切片处理。收片后将载玻片在60 ℃真空干燥箱内烘烤4 h,烘烤方法为先平放烤制2 h,再竖放烤制2 h。将各组载玻片用二甲苯再次进行透明、水化处理,清洗后用苏木精染色液与伊红染色液对各组载玻片染色。将染色后的组织再次进行脱水处理,用二甲苯溶液进行透明处理,处理后用中性树脂封片。将封片后的组织静置一段时间后置于显微镜下观察染色结果。

1.9 DNA含量检测

分别取15 mg新鲜猪主动脉和脱细胞后的猪主动脉,将其处理成极细小碎块后,按照基因组DNA小量抽提试剂盒中的步骤提取各组猪的主动脉中的DNA,在1.5 mL的离心管中取适量纯化后的含DNA液体于DNA含量检测仪上进行测定。各组猪主动脉每组测量3～5次,观察分析DNA测量结果,判断猪主动脉细胞是否脱除干净。

2 实验结果

为进一步探究支架的具体性能,对新鲜和脱细胞的猪主动脉进行H&E染色DNA含量检测,并对各组支架进行形貌及结构观察、傅里叶红外光谱分析、力学性能测试、降解能力测定等理化性质方面的测定。

2.1 H&E染色结果及DNA含量检测结果

图2(a)是新鲜猪主动脉经H&E染色后的显微镜观察效果图。图2(b)为经脱细胞处理后的猪主动脉经H&E染色显微镜观察效果图。2幅图的背景色均为粉红色,主要是因细胞质被伊红染液染色而成,可知经脱细胞处理后的猪主动脉保留了一定的细胞外基质。观察到左图中存在大量的蓝黑色颗粒,分布较为密集,而右图无明显的蓝色颗粒分布。蓝黑色颗粒存在的原因是新鲜猪主动脉含有较多的细胞核,从而被苏木精染色液染成蓝色。对比可知,对新鲜猪主动脉的脱细胞处理效果较好,细胞脱除较为彻底,无明显的细胞残余。

图2 H&E染色结果与DNA含量检测结果

利用基因组DNA小量抽提试剂盒提取新鲜猪主动脉和脱细胞后的猪主动脉的DNA,并用DNA检测仪测定。每种测3次以减少测量误差。新鲜猪主动脉组织中DNA含量为164.47±6.47 ng/mg,脱细胞后的血管组织中DNA含量为 34.67±2.16 ng/mg,达到脱细胞的标准,即脱细胞组织残留DNA含量不超过50 ng/mg。如图2(c)所示,新鲜猪主动脉经过脱细胞后,DNA减少明显,新鲜猪主动脉组织与脱细胞后的猪主动脉组织中的DNA含量有显著的统计学差异。由此可知,对新鲜猪主动脉脱细胞处理较为彻底。图2(c)中,“****”表示统计显著差异(P≤0.000 1)。

2.2 支架的微观形貌及结构观察结果

将各组从模具中脱出,进行大体观察。如图3所示,支架为白色管状,内径孔清晰贯通,显示内径3 mm、外径5 mm左右,大体外观形状与人体血管相同。

图3 支架形貌及尺寸

为观察支架材料的微观结构,对支架材料进行SEM分析。图4(a)所示为各组血管支架分别放大3 000倍、500倍的表面SEM结果。图4(b)所示为各组血管支架放大500倍的截面SEM结果。

图4 不同比例DVMG-PCL支架的SEM图

由于各组支架材料采用反复包裹成型,相较于静电纺丝技术得到的血管支架而言受自然因素影响较大,故导致各组材料表面不均匀。反观各组截面的SEM图,较表面而言较为均匀。各组样品的表面SEM图显示表面结构无明显孔隙,截面SEM显示表面结构有明显孔隙,以便于细胞附着。出现此现象的可能原因是由于样品在室温下固化时混合溶液中的冰醋酸挥发所致,导致表面PCL占比较高,孔隙不明显。但PCL具有良好的可降解性能,同时截面SEM图出现的孔隙表明,血管支架置于体内表征时随着支架的降解将会出现孔隙。由于各组支架孔隙较少,采用反复包裹定型的方法制备血管支架存在不足。

2.3 傅里叶红外光谱分析结果

图5为DVM、PCL、不同比例DVMG-PCL支架的红外光谱分析图。分别对各组DVMG比例的血管支架进行光谱分析,除DVM外,各组DVMG与PCL混合支架中的光谱形态大致相同。其中,PCL的特征光谱占主导地位。

图5 DVM、不同比例DVMG/PCL支架 红外光谱分析图

由图5中的DVM的红外光谱图可知,DVM的吸收特征峰分别为3 286、1 633、1 532、1 240 cm-1;在3 200～3 300 cm-1处有1个羟基伸缩振动峰,峰宽而钝;在1 630～1 640 cm-1、1 530～1 540 cm-1、1 240 cm-1处出现的吸收峰分别是由酰胺I、酰胺II、酰胺III的振动引起的。各DVMG-PCL血管支架在1 150～1 170 cm-1范围内有1个特征吸收峰,由C-N拉伸振动引起;在1 720～1 730 cm-1范围内的谱带区域产生尖峰,这是由于羰基伸缩振动引起;饱和烃的C-H伸缩振动峰出现在2 950 cm-1附近。

2.4 支架的力学性能结果

图6(a)所示为DVMG与PCL进行不同比例混合得到的血管支架材料的应力应变曲线。由该曲线斜率可初步判断4组支架的拉伸模量大小,DVMG∶PCL为0∶1 (即纯PCL组)时,其斜率最大,1.5∶1组支架和1∶1组支架的应力应变曲线的斜率相近,5∶1组支架的应力应变曲线斜率最小。

图6(b)所示为DVMG和PCL进行不同比例混合得到的血管支架材料的拉伸模量图。由该柱状图可知,PCL支架、DVMG∶PCL分别为1∶1,1.5∶1,5∶1的材料支架的拉伸模量值依次为49.00±9.52 MPa,46.29±3.08 MPa,38.77±2.07 MPa和31.18±2.80 MPa。其中,PCL支架的组内误差最大,DVMG∶PCL为1.5∶1组与5∶1组的组内误差相近。DVMG∶PCL为0∶1组与1∶1组、0∶1组与1.5∶1组之间的显著性差异P值分别为0.607 167 563、0.080 538,故DVMG∶PCL为0∶1与1∶1、1.5∶1组差异性不显著。DVMG∶PCL为0∶1组与5∶1组、1∶1组与1.5∶1组、1∶1组与5∶1组、1.5∶1组与5∶1组之间的显著性差异P值分别为0.011 478、0.006 746、0.000 347、0.004 764,均表示这几组不同DVMG∶PCL比例血管支架材料之间的差异性显著。图6(b)中,ns表示差异不显著(P>0.05),*表示差异显著(P≤0.05),**表示差异极显著(P≤0.01),***表示差异极其显著(P≤0.001)。

图6可知,DVMG的含量大小对血管支架的力学性能有一定的影响。用PCL参与制备的血管支架拉伸模量单位达到了兆帕,总体较硬,加入DVMG的意义在于改善纯PCL支架的硬度,使其富有较好的弹性,能更好地达到天然血管的标准。同纯PCL支架相比,DVMG∶PCL为1∶1、1.5∶1、5∶1组支架的拉伸模量值均变小,故这3组支架材料受力时,形变相对于纯PCL支架较大,硬度降低,力学性能得到了改善。但DVMG含量的增加对PCL参与形成的血管支架的硬度改善有一定限制,DVMG∶PCL为5∶1组的支架材料相较于1.5∶1组的变化不大。在添加了DVMG的3组血管支架中,DVMG∶PCL为5∶1组血管支架材料的拉伸模量最小,在受力时产生的拉伸形变较大,使该支架的硬度比起纯PCL支架要低,故此比例的血管支架力学性能较佳。

图6 不同比例DVMG/PCL支架的力学性能

2.5 支架的降解能力测定结果

如图7所示,分别将相同质量、不同比例的DVMG/PCL血管支架置于PBS缓冲溶液中,于37 ℃环境条件下在恒温气浴振荡器中进行为期1个月的降解速率测定,推测其在生物体内的生物降解性能。图7(a)和图7(b)分别表示不同比例DVMG/PCL支架的部分剩余率和支架总剩余率。

由图7(a)可知,材料支架每周同上一周的比值存在变化,数值均在88%以上,可知材料每周均发生降解。其中,DVMG∶PCL为5∶1的支架材料在进行第1次为期1周的降解后质量下降幅度较大。由图7(b)可知,随着降解时间的延长,材料支架的总剩余率均在减小,且DVMG∶PCL为5∶1组支架的总剩余率最小,可知该比例的DVMG/PCL血管支架降解最快,相对质量变化较大;DVMG∶PCL为0∶1组支架的总剩余率最大,可知该比例的DVMG/PCL血管支架降解较慢,相对质量变化小。

图7 不同比例DVMG/PCL支架的降解性能

对4组支架材料进行比较,发现添加的DVMG含量的改变会对血管支架降解性产生影响。纯PCL支架降解速率极慢,证实该支架不利于体内植入;DVMG∶PCL为1∶1组支架和 DVMG∶PCL为1.5∶1组支架的降解速率差距不大,但相较于纯PCL组而言,降解速率下降明显;DVMG∶PCL为 5∶1组的血管支架在1个月的降解时间内降解速率幅度下降最大。可见,DVMG在混合支架中的比例会对制备得到的DVMG-PCL支架降解速率产生重要影响,可为体内植入研究提供参考。

3 结束语

本研究验证了DVMG与PCL复合制备脱细胞血管支架的可行性,2种材料的复合可使血管支架具有合适的力学性能和降解速率。通过改变DVMG的含量,验证了DVMG含量与DVMG/PCL血管支架材料的力学性能、降解性能等因素之间的关系,即DVMG含量越高,相较于纯PCL支架,支架的刚度降低,降解速率变快,更加利于血管的再生。

细胞外基质(extracellular matrix,ECM)为细胞提供了空间结构和大量的细胞外信号分子。ECM和细胞之间的相互作用错综复杂,能够调节组织稳态和组织再生中涉及的各种过程,如细胞生长、迁移、分化和新ECM产生。对于脱细胞血管,主要是由ECM组成,包含胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖等成分。这些成分对细胞粘附、迁移、增殖和分化至关重要,使血管具有承受血压变化的机械性能[16]。植入体内后,这些天然基质能诱导组织重塑和再生。除了脱细胞血管,其他脱细胞组织也具有制造血管支架的潜力。已有研究使用脱细胞人绒毛膜构建了一种血管移植物,这种血管移植物与内皮细胞相容并具有血液相容性和抗菌性质,其力学性能和自体小直径血管置换的黄金标准大隐静脉相似[17]。此外,小肠粘膜下层是食品和药物管理局批准用于制造再生生物材料的常见脱细胞基质生物材料。脱细胞支架由于密集的胶原纤维网络而具有较低的细胞通透性,而脱细胞基质凝胶则改善了这一缺限。水凝胶具有高含水量,因此常作为细胞递送和包封的载体[18]。脱细胞基质凝胶不仅具有天然ECM的生物化学线索、特异性结构及微环境,还表现出高度可调的机械性能、生物活性和生物降解性。脱细胞基质凝胶中的特定成分可以通过促进M1型巨噬细胞向M2型转化来减少炎症、加速组织修复[19]。然而,单纯的脱细胞基质凝胶力学性能较弱,常与其他高分子材料复合以进一步增强其性能。例如,本研究通过将丝素蛋白与DVMG复合改善支架的整体力学性能,降低降解速率,在保留天然组织的生化特性的同时具有快速血管化的能力。文献[20]中,随着DVMG含量的增加,支架的刚度变低,降解速率加快,与本研究得到的结论类似。

PCL是FDA批准的高分子材料,在组织工程血管领域应用广泛。有研究人员将PCL/聚二恶烷酮共同静电纺丝制备了小直径混合血管移植物,其中,PCL纳米纤维的缓慢降解保持了管状结构的完整性,而具有快速降解速率的聚二恶烷酮纤维允许细胞浸润和ECM沉积[20]。纯PCL血管支架不易降解,且力学性能与天然血管不匹配,由于生物相容性低,可能会导致出现其他并发症。例如,与平滑肌再生不匹配的降解率导致PCL构成的电纺血管移植物增生和钙化[21]。

脱细胞基质凝胶还具有可修饰性和可加工性[22]。脱细胞基质凝胶可以负载细胞、治疗药物或其他生物活性分子,常通过静电纺丝或3D打印制备出符合要求的血管支架。静电纺丝技术可以模拟ECM的纳米纤维结构,有利于细胞的粘附和增殖。有研究通过静电纺丝将PCL与大鼠主动脉基质复合,然后加载肝素和血管内皮生长因子来制造血管移植物。该移植物表现出良好的血液相容性和生物相容性,肝素的加入使得血管内皮生长因子能更可控地释放[23]。3D打印技术可以重现血管的分层复杂结构,精确控制3D结构中细胞的位置。有研究开发了一种DVMG和明胶、藻酸盐、细胞组合的新型生物油墨,该生物油墨能够完整再现符合天然组织形状和功能的血管支架,血管支架具有一定的机械性能和良好的生物相容性[24]。本研究制备的支架虽然结构简单,但与上述方法相比制作更加便捷,成本更低。下一步研究将关注支架材料对细胞的影响,考虑植入动物体内观察生物相容性和促进血管再生的能力。