李治国，盛光玉，赵文卿，信璐瑶，井波，王云峰，余复昌，齐萌

摘 要：为鉴定阿拉尔市散养鸡感染的线虫种类，采用形态学观察和PCR法对阿拉尔市2只林下散养鸡盲肠中发现的43条线虫进行种类鉴定。经形态学观察，虫体外观呈白色短线状，两端较细；雌虫阴门到尾端距离为4.12～6.35mm；口腔短，食道前部圆柱状；雄虫尾端有2根不等长的交合刺，初步鉴定为鸡异刺线虫。基于线虫ITS基因位点，对2条虫体DNA进行PCR扩增和测序，经序列比对，2条虫体序列与我国四川省鸡源异刺线虫序列同源性为99.90%，鉴定为鸡异刺线虫。种系发育分析显示，本研究所获鸡源异刺线虫序列与禽源异刺线虫同处于1个进化支，与其他异刺线虫属的线虫形成不同分支。研究结果为鸡源异刺线虫的种类鉴定和遗传进化分析提供了基础资料。

关键词：异刺线虫；形态学；鉴定；种类；鸡

中图分类号：S858.312.7文献标识码：B文章编号：1673-1085（2023）05-0008-05

鸡异刺线虫（Heterakis gallinarum）是常见的寄生于鸡盲肠内的线虫之一，可引起鸡食欲减退，下痢，发育迟缓，消瘦，产蛋量下降等症状[1]。异刺线虫除引起宿主感染和发病外，还可作为火鸡组织滴虫（Histomonas meleagridis）的传播者，导致宿主发生高死亡率的组织滴虫病，给养禽业带来较大的经济损失[2]。鸡异刺线虫病无明显季节性，多见于卫生条件相对较差的散养鸡群。成鸡感染异刺线虫后，通常不表现出临床症状。异刺线虫一般通过对解剖发现的虫体进行形态学观察来进行鉴定。近年来，研究者采用分子生物学技术对我国鸡源、孔雀源和七彩山鸡源异刺线虫进行了系统进化分析，发现不同禽源异刺线虫存在一定的遗传多样分布特征，其中，四川鸡源异刺线虫种群具有丰富的单倍型多样性，种群间基因交流频繁，群体遗传分化不明显[2-4]。为进一步了解我国不同地区禽源异刺线虫的遗传进化多样性，本调查通过形态学观察鉴定阿拉尔市散养鸡鸡源异刺线虫，并结合分子生物学方法对其进行种系发育分析，以期为该地区鸡源异刺线虫病的防治提供基础参考资料。

1 材料与方法

1.1 虫体样本收集

自阿拉尔市某林下肉鸡养殖户购买2只散养鸡，解剖后自鸡盲肠内发现虫体，用生理盐水漂洗3次，立即投入70℃的70%乙醇固定液中进行固定，使虫体伸展，固定液冷却后长期保存。

1.2 主要试剂和仪器

组织基因组DNA提取试剂盒（EasyPure Genomic

DNA Kit）、2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）、DL2000 Marker，購自北京全式金生物技术有限公司；体式显微镜（Nikon SMZ18）购自日本Nikon公司；PCR仪EP （Mastercycler nexus）购自德国Eppendorf公司；凝胶成像系统（Gel Doc XR＋）购自美国Bio-Rad公司。

1.3 虫体形态学观察

观察虫体外部形态，使用标尺测量虫体长度。虫体标本经乳酸酚溶液透明6 h后，使用光学显微镜对虫体的唇、食道球、雄虫的交合刺和雌虫的生殖道等部位进行形态结构观察，拍摄照片，测量雌虫阴门到尾端长度，根据参考资料[5]进行虫种鉴定。

1.4 虫体基因组DNA提取

将分离获得的虫体随机挑取2条，置于1.5 mL的离心管中，用手持式组织研磨器研磨后，加入组织裂解液和蛋白酶uK，37℃水浴加热3 h，按照试剂盒操作步骤提取虫体DNA，置于-20℃保存。

1.5 引物设计

参照古小彬等[2]报道的线虫ITS序列通用引物序列设计引物，上游引物为NC5：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′，下游引物为NC2：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′，引物由苏州金维智生物科技有限公司合成。

1.6 PCR扩增

PCR扩增反应体系为25 ?L：2×EasyTaq Mix（12.5 ?L），上下游引物（各0.3 ?L），虫体DNA模板（1 ?L），ddH2O（10.9 ?L）。PCR反应条件为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸5 min。阳性对照样本为鸽源蛔虫DNA，由塔里木大学兽医寄生虫学实验室鉴定保存，阴性对照为双蒸水。PCR反应结束后，取5 ?L扩增产物，于1%琼脂糖凝胶中进行电泳，结果在凝胶成像仪中进行观察。将阳性PCR产物送至苏州金维智生物科技有限公司进行双向测序。

1.7 序列比对和系统进化分析

经公司测序所获的2条序列，双向序列拼接完成后，在NCBI数据库中进行BLAST同源序列搜索，用Clustal X 2.1软件进行比对分析，根据序列比对结果鉴定线虫种类。以旋毛线虫（Trichinella spiralis）为外群构建种系发育进化树，下载GenBank中相关同源参考序列，见表1。使用MGEA7.0软件，选用邻接法（Neighbor-Joining， NJ）中的Kimura-2-parameter模型，采用bootstrap对进化树进行可靠性分析，1 000个重复，对本研究所获线虫序列进行种系发育分析。

2 结果

2.1 虫体形态学鉴定

对2只散养鸡进行剖检，在盲肠内肉眼观察发现43条线虫，虫体外观呈白色短线状，两端较细，显微镜下可见虫体头端有3片唇，口腔短，食道前部圆柱状（图1A），测量雌虫体长6.22～12.32 mm，雄虫体长4.23～8.16 mm；雌虫阴门到尾端距离为4.12～6.35 mm（图1B）；雄虫尾部尖细，泄殖孔前具有角质吸盘，左右交合刺不等长（图1C）。结合线虫的寄生部位和虫体形态学观察，初步鉴定43条线虫均为鸡异刺线虫。

2.2 虫体DNA的PCR扩增结果

基于线虫通用ITS基因位点，2份虫体DNA样本均成功扩增出1 200 bp左右大小条带，与目的片段条带一致，阴性对照样本未出现条带扩增（图2）。

2.3 虫体序列比对和种类鉴定

基于ITS基因位点，2条虫体均成功双向测序，序列均一致，与我国四川省鸡源异刺线虫序列（序列登录号：KT310153）同源性为99.90%，其在第33核苷酸位置处增加1個T碱基。结合形态学观察和序列分析，鉴定本次调查所获虫体为鸡异刺线虫。

2.4 所获鸡异刺线虫的种系发育分析

根据构建的种系发育进化树可以看出，本研究所获鸡源异刺线虫序列与我国、突尼斯、印度鸡源、波兰鹅源和美国草原松鸡源异刺线虫序列同处一个进化支，与孟加拉国鸡源异刺线虫形成小的亚群分支；其他禽源贝拉异刺线虫、异形异刺线虫和雉异刺线虫聚类形成1个进化支，与鸡异刺线虫序列形成2个群组；鼠源鼠异刺线虫单独聚类形成1个进化支（图3）。结果提示不同宿主之间，鸡异刺线虫序列无明显宿主差异，存在一定的地理隔离差异。

3 讨论

鸡异刺线虫常引起禽类群体感染，对养禽业造成一定的经济损失。郭小玲等[6]报道确山县某乡养殖户鸡群感染异刺线虫后，采食量减少，羽毛粗糙，下痢，排米黄色、褐色稀粪，鸡只陆续死亡。黄潇航等[4]报道福建省某户庭院饲养的七彩山鸡感染异刺线虫后，表现出精神不振、消瘦、采食量下降和腹泻等症状。鉴定线虫种类传统方法是蠕虫形态学观察，而近年来，分子生物学方法已普遍应用到线虫种类鉴定中，提高了线虫种类鉴定的准确性。本研究结合形态学观察和虫体序列分析，鉴定阿拉尔市散养鸡感染的线虫种类为鸡异刺线虫，结果提示户外散养鸡群应给予合理的驱虫预防，根据饲养场地的实际情况定期驱虫，并加强环境卫生管理。

基于ITS基因序列，吕召宏等[7]调查发现广州市2条鸡源异刺线虫的序列与澳大利亚鸡源异刺线虫的ITS序列具有较小的种内变异，在第170碱基处比澳大利亚鸡源异刺线虫序列增加1个C碱基。刘路瑶等[3]自合肥市野生动物园孔雀盲肠内分离出48条异刺线虫，基于ITS-2基因序列进行分析，其与鸡异刺线虫序列同源性较高，鉴定为鸡异刺线虫。古小彬等[2]基于ITS基因序列，对四川省鸡源异刺线虫进行遗传多样性研究，结果表明鸡异刺线虫ITS1基因序列种间变异较ITS2基因序列大，59条序列共检测出20个变异位点和14个单倍型，核苷酸多样性和单倍型多样性分别为0.00094和0.532，表现出较低的遗传多样性。本研究基于ITS基因序列，所获鸡源异刺线虫序列与禽源异刺线虫同处于1个进化支，与其他异刺线虫属形成不同分支，不同宿主源异刺线虫的序列无明显差异，不同地区鸡异刺线虫的序列具有碱基替换或缺失，提示鸡异刺线虫存在一定的区域性遗传进化。

4 结论

本调查所获鸡源异刺线虫存在一定的区域性遗传进化，研究结果为鸡源异刺线虫的种类鉴定和遗传进化提供了基础资料。

参考文献：

[1] BAZH E K. Molecular identification and phylogenetic analysis of Heterakis gallinae from native chickens in Egypt[J]. Parasitology research， 2013， 112（10）： 3557-3560.

[2] 古小彬，朱俊扬，王保健，等.四川地区鸡异刺线虫核糖体转录间隔区（ITS1/2）序列的遗传变异分析[J].畜牧兽医学报，2016，47（04）：796-804.

[3] 刘路瑶，杨聪山，章翔，等. 孔雀源异刺线虫的形态学特征及分子鉴定[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2021，39（06）：816-820.

[4] 黄潇航，彭佳佳，李诗艺，等.一例七彩山鸡异刺线虫感染的临床诊断及其分子生物学鉴定[J].中国动物检疫，2021，38（08）：95-97.

[5] 廖党金，黄兵.中国畜禽线虫形态分类彩色图谱[M].北京：北京科学出版社，2016：50-51.

[6] 郭小玲，朱凤霞，许瑞，等.1例鸡异刺线虫病与组织滴虫病混合感染的诊疗与分析[J]. 养禽与禽病防治，2019（01）：37-38.

[7] 吕召宏，徐广庭，林瑞庆，等.鸡异刺线虫ITS rDNA的PCR扩增、克隆及序列分析[J]. 中国畜牧兽医，2005（08）：41-44.

Morphological Observation and Molecular Identification of Heterakis gallinarum from Free Breeding Chickens in Alar

LI Zhiguo， SHENG Guangyu， ZHAO Wenqing， XIN Luyao， JING Bo， WANG Yunfeng， YU Fuchang， QI Meng

（College of Animal Science and Technology， Tarim University/Engineering Laboratory of Tarim Animal Diseases Diagnosis and Control， Xinjiang Production & Construction Corps， Alar  843300， China）

Abstract：   In order to identify the species of nematode in free breeding chickens in Alar， 43 nematodes were collected from two free breeding chickens and were identified the species used by morphological observation and PCR. Morphological observation showed that the nematode was white， and short linear with thin ends. The distance from vulva to caudal end of the female was 4.12～6.35 mm， with short mouth and anterior esophagus cylindrical. The male had two unequal-length copula spines at the tail end. According to the preliminary results， nematodes were the identified as Heterakis gallinarum. Based on the ITS gene， the DNA of the two nematodes were amplified by PCR and sequenced. The sequences of the two nematodes shared 99.90% homology with the sequences of H. gallinarum isolated from chickens in Sichuan Province， China， and were identified as H. gallinarum. Phylogenetic analysis showed that the sequences of H. gallinarum obtained in this study belonged to the same clade as that of H. gallinarum from avian origin， and formed different branches from other species of Heterakis. These results provide basic information for the species identification and phylogenetic analysis of H. gallinarum in chickens.

Keywords： Heterakis gallinarum; Morphological observation; Identification; Type; Chicken