刘双龙　余凤玉　宋薇薇　杨德洁　牛晓庆

关键词：椰子病害；奇异根串珠霉菌；拮抗细菌；生物防治

中图分类号：S476.1 文献标识码：A

椰子（Cocos nucifera）属于棕榈科椰子属，为典型的热带经济作物，是海南的“三棵树”之一[1]。2018 年海南省的椰子种植面积高达3.36 万hm²，经济产值达3.86 亿元，带动多地农户脱贫致富[2]。近几年随着椰子种植面积的增加，由奇异根串珠霉菌（Thielaviopsis paradoxa）引起的椰子泻血病逐年加重，该病害主要危害椰子树干，病部流出红色液体，后期则变成铁锈色，现已成为椰子主要病害之一[3]，目前海南省各市（县）椰子泻血病均有发生，部分市县发病率达40%，死亡率达5%，给椰子种植户带来极大的损失[4]。此外，温碧柔等[5]从腐烂椰果中分离并验证奇异根串珠霉菌也是导致椰子果腐的“真凶”。目前关于椰子泻血病和椰子奇异根串珠霉果腐病的防治多集中于化学防治[4]，极易使致病菌产生抗性，并且随着化学药剂使用量的不断加大，导致其大面积残留，给环境造成严重的威胁[6]，因此寻找防治椰子泻血病的生物防治方法具有重要意义。目前已报道的奇异根串珠霉菌生防菌包括浅灰链霉菌（Streptomycesgriseolus）、鼠灰链霉菌（S. murinus）等[3]，为丰富奇异根串珠霉菌生防菌的资源，本研究采用平板对峙法测定2 株生防菌对奇异根串珠霉菌的抑制效果，对其抑菌作用进行初步研究，并对发酵条件进行优化，以期为椰子泻血病的生物防治提供安全、有效的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 供试生防菌：粪产碱菌brj-21（Alcaligenes faecalis）、铜绿假单胞菌wrj-2-5（Pseudomonas aeruginosa）由本实验室分离保存；供试病原菌：奇异根串珠霉菌（T. paradoxa）、椰子灰斑病菌（Pestalotiopsis palmarum）、椰子可可毛色二孢果腐病菌（Lasiodiplodia theobromae）和椰子心腐病菌（Pestalotiopsis sp.）由本实验室分离保存。实验所用椰果为中国热带农业科学院椰子研究所‘文椰3 号品种。

1.1.2 供试培养基 PDA 培养基、LB 培养基、NYBD 液体培养基等，以上培养基按常规方法配置[7-8]。

1.2 方法

1.2.1 生防菌的抑制作用测定 采用平板对峙法[9-10]测定2 株生防菌对奇异根串珠霉菌、椰子灰斑病菌、椰子可可毛色二孢果腐病菌和椰子心腐病菌的抑制效果。其中，对奇异根串珠霉菌的抑制效果通过生防菌菌块与菌液进行测定，对其他病原菌的抑制效果通过生防菌菌块测定。

抑菌率=（对照组菌落直径－测试组菌落直径）/对照组菌落直径×100%

1.2.2 室内防治效果实验 采用椰果刺伤接种[11]进行室内防效验证。选取健康且大小一致的椰果作为接种对象，先将椰果用清水冲洗干净，晾干后用75%酒精消毒30 s，再用无菌水将椰果清洗3 次，晾干后使用一次性注射器针头将果柄处椰果扎破，每个重复扎20～30 次，用灭菌吸水纸、纱布盖于伤口处。预防试验（处理1～3）：用无菌枪头吸取NYBD 培养基中培养的生防菌菌液（2×10⁷CFU/mL）100 μL 接种于果柄针刺处，然后分别在接种1、3、5 d 后将奇异根串珠霉菌菌丝块（5 mm²）接于椰果伤口处；治疗试验（处理4～6）：先将奇异根串珠霉菌菌丝块（5 mm²）接于椰果伤口处，然后分别在接种2、4、6 d 后在果柄处接种NYBD 培养基中培养的生防菌菌液（2×10⁷CFU/mL），共进行6 组处理。以对应处理的生防菌液换成NYBD 液体培养基作为对照，每处理3 次重复，置于28 ℃恒温培养箱内保湿培养，光照周期为12 h 光照、12 h 黑暗，每天连续观察并记录椰果发病情况。病斑面积S=1/4π×长×宽，测量长、宽的方法：每个病斑量其最长和最宽处（二者成直角）[12]。

1.2.3 生防菌发酵条件优化 （1）种子液的制备。挑取生防菌株单菌落于100 mL LB 液体培养基中，置于恒温摇床中，28 ℃、180 r/min 振荡培养24 h，备用。

（2）发酵时间对生防菌株的影响。使用LB培养基，分别在12、24、36、48、60、72 h 测量细菌浓度，在0～12 h 内每间隔2 h 测量1 次，12～24 h 每间隔4 h 测量1 次。24 h 后每12 h 测1 次，根据所得数据绘制细菌的生长曲线。

（3）转速对生防菌株的影响。采用上述优化的发酵条件，分别调整转速为120、150、180、210、240 r/min，培养24 h 后测量菌液浓度，确定最佳摇床转速。

（4）温度对生防菌株的影响。采用上述优化的发酵条件，分别设置温度为24、28、32、36 ℃进行发酵培养24 h，测定不同温度的菌液浓度。

（5）初始pH 对生防菌株的影响。采用上述优化的发酵條件，分别配置pH 为4.0、6.0、7.0、8.0、10.0 的培养基，28 ℃、180 r/min 振荡培养24 h 后，测定不同pH 环境中细菌生长情况，以确定最佳初始pH。

（6）始初接菌量对生防菌株的影响。采用上述优化的发酵条件，分别接种含量为2%、4%、6%、8%、10%的种子液。28 ℃、180 r/min 振荡培养24 h 后，测量各培养基中不同初始接菌量的细菌浓度，以确定最佳的初始接菌量[7-8]。

1.3 数据处理

采用IBM SPSS Statistics Version 22.0 软件进行单因素方差分析，并且使用Duncans 法进行显著性检验（P<0.05），使用GraphPad prim 软件制图。

2 结果与分析

2.1 生防菌对奇异根串珠霉菌的抑制作用

通过平板对峙实验， 发现菌株brj-21 和wrj-2-5 菌体对奇异根串珠霉菌的抑菌率分别为74.33%和71.00%，抑菌带宽分别为5.83、7.00 mm；菌液对奇异根串珠霉菌的抑菌率分别为78.00%和69.00%，抑菌带宽分别为9.17、6.39 mm（图1，表1）。

2.2 生防菌对其他病原菌的抑制作用

2 株生防菌brj-21 和wrj-2-5 对椰子心腐病、椰子灰斑病和椰子可可毛色二孢果腐病的病原菌均有一定的抑制效果，其中wrj-2-5 对椰子灰斑病菌的抑制作用最强，达83.78%，brj-21 对椰子灰斑病菌的抑制作用最强，达81.08%，2 株生防菌对椰子心腐病菌和椰子可可毛色二孢果腐病菌的抑菌率均在70%以上（表2）。

2.3 离体椰果实验

在离体椰果上接种生防菌对奇异根串珠霉菌的扩展有很好的抑制作用（图2）。其中，在接种wrj-2-5 和brj-21 菌株5 d 后再接种病原菌奇异根串珠霉菌，对奇异根串珠霉菌抑制效果最好，病斑面积分别为0.76、0.79 cm²，显著小于对照（3.14 cm²）；在接种病原菌2 d 后接种生防菌wrj-2-5 和brj-21 的效果最好，病斑面积分别为1.26、1.77 cm²，显著小于对照（4.45 cm²）。综上，生防菌wrj-2-5 和brj-21 对奇异根串珠霉菌的擴展有很好的抑制作用，且接种生防菌越早，其效果越好（表3）。

2.4 发酵条件优化

2.4.1 菌株wrj-2-5 和brj-21 生长曲线 菌株wrj-2-5 和brj-21 的生长曲线如图3 所示。菌株wrj-2-5 的OD₆₀₀值在0～36 h 内随时间延长而增大，菌数呈指数增加进入对数期并在36 h 时达到最大值，在36 h 后进入稳定期和衰亡期。菌株brj-21 的OD₆₀₀值在0～24 h 内随时间延长而增大，进入对数期并在24 h 时达到最大值，在24 h 后OD₆₀₀值随培养时间延长而降低，整个群体进入稳定期和衰亡期。

2.4.2 转速对菌株wrj-2-5 和brj-21 生长的影响不同转速对菌株wrj-2-5 和brj-21 生长具有显著差异。当摇床转速为120～180 r/min 时，wrj-2-5 和brj-21 菌液浓度均随转速增加而增大，当转速提高到180 r/min 以上时，菌液浓度无显著差异（图4）。

2.4.3 温度对菌株wrj-2-5 和brj-21 生长的影响在不同温度下，菌株wrj-2-5 和brj-21 均能生长，菌株wrj-2-5 在28 ℃时生长最快，菌液浓度显著高于其他温度；高于28 ℃时，菌液浓度呈逐渐下降趋势。菌株brj-21 在28～32 ℃时生长最快，且在此温度范围内无显著差异；高于32 ℃时，菌液浓度呈逐渐下降趋势（图5）。温度过高或过低对菌株的生长均有不良影响，最终确定菌株wrj-2-5的最佳发酵温度为28 ℃，菌株brj-21 的最佳发酵温度为28～32 ℃。

2.4.4 初始pH 对菌株wrj-2-5 和brj-21 生长的影响 不同初始pH 对菌株wrj-2-5 和brj-21 生长的影响存在显著性差异。当初始pH 为6.0～8.0 时，菌株wrj-2-5 和brj-21 生长均较好，在此范围内无显著性差异。当pH 为10 时，菌株wrj-2-5 和brj-21的菌液浓度相对较低，生长缓慢；当pH 为4.0 时，菌株wrj-2-5 和brj-21 基本不生长（图6）。说明过酸或过碱的环境对菌株wrj-2-5 和brj-21 的生长均有抑制作用，因此确定菌株wrj-2-5 和brj-21 的最适pH 为6.0～8.0。

2.4.5 初始接种量对菌株wrj-2-5 和brj-21 生长的影响 当初始接种量为8%时，菌株wrj-2-5 和brj-21 在经过24 h 振荡培养后浓度最高，其次是接种量为10%和6%的菌液浓度（图7）。

3 讨论

研究结果表明，生防菌粪产碱菌brj-21 和铜绿假单胞菌wrj-2-5 对奇异根串珠霉菌有较强的抑菌作用，抑菌率菌均在70%以上，对其他病原菌也有很好的抑制作用。已有研究证明，铜绿假单胞菌对番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、甜瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）及番茄青枯病菌（Ralstonia solanacearum）均有较好的抑制作用，对番茄枯萎病盆栽防效达81%[13-14]，对烟草青枯病的防治效果优于农用链霉素，防效为60%[15]。在铜绿假单胞菌的抑菌机理方面，有研究发现铜绿假单胞菌可通过产生吩嗪-1-羧酸、藤黄绿脓菌素、3，4-二羟基-N-甲基-4-苯并二氢吡喃酮-丁酰胺等抑制病原菌生长[16-17]，同时还可产生铁载体，通过螯合自然界中的微量铁元素，用特异的转运系统将其转移至体内，以促进其铁元素的吸收[18]。而有关粪产碱菌的研究报道较少，现有研究表明粪产碱菌可对多种有害物质，如亚砷酸盐、苯酚、硫化氢进行降解，还可产生羟胺类等抑菌物质[19]。此外，有研究发现粪产碱菌51-A和51-B 对根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）具有较强的抑制作用，盆栽实验表明，51-A和51-B 可显著抑制根癌瘤的形成，对向日葵根癌病的防效分别为98.0%和97.0%[20]。YUEN[21-22]研究发现，粪产碱菌对镰刀菌（Fusarium oxysporum）也有较强的抑制作用。

在离体椰果接种实验中， 菌株brj-21 和wrj-2-5 的预防作用较优于治疗作用，在病原菌侵染前3～5 d 进行接菌，其预防效果最佳。初步推测可能是因为奇异根串珠霉菌侵染椰果之前，生防菌抢占了病原菌的侵染位点，或激发了植物自身的免疫应答系统[23]，从而减弱发病程度。下一步将重点研究生防菌在椰子内的定殖及其相关基因的表达。本研究还对生防菌株的发酵条件进行优化，生防菌在生长过程中能产生多种抑菌物质，在适宜的发酵条件下，其抑菌物质的产量将更丰富，还能提高生物农药制剂的抑菌效果，进而节约生产成本[24]。研究得出，铜绿假单胞菌wrj-2-5的最佳发酵条件为接种量8%、转速180 r/min、温度28 ℃，初始pH 为6.0～8.0，培养36 h，这与卢晓虹等[14]对铜绿假单胞菌确定的发酵条件有所差异，可能是由于菌株来源、生境、用途等不同造成的，后续将进一步验证。

本研究中的生防菌株wrj-2-5 和brj-21 在防治由奇异根串珠霉菌引起的椰子病害中有较大的生防潜力，生防菌株的应用将对椰子病害的防治提供更为绿色安全的方法。今后将加强对生防菌株wrj-2-5 和brj-21 次生代谢产物、菌株在植物体内定殖和植物内在抗性反应等方面的研究。