张媛媛　鹿志伟　李茂富　姚全胜　侯晓婉

关键词：菠萝；黑心病，抗坏血酸过氧化物酶；qPCR；克隆

中图分类号：S436.68 文献标识码：A

菠萝[Ananas comosus （Linn.） Merr.]是凤梨科凤梨属多年生单子叶常绿草本果树，是世界三大热带水果之一，也是我国热区的主要经济作物，主要集中在台湾、广东、广西、福建、海南等省（区）。广东省是我国菠萝生产第一大省，其主栽品种为‘巴厘菠萝，种植面积达35 639 hm²，产量达111.0 万t[1-3]。然而‘巴厘菠萝在采后贮藏和运输期间极易发生黑心病（internal browning，IB），使果髓乃至果肉均变为黑褐色，导致果实品质显著降低，耐储能力大幅度缩减，给种植户以及收果商带来严重的损失[3]。

黑心病是由低温（昼/夜<25 ℃/20 ℃）引起的生理失调症，该病害发生的实质是酶促氧化褐变[1， 4]。前人通过对不同园艺物种冷害生理反应的研究发现，长期低温导致的液泡膜损伤、线粒体肿胀和内部组织褐变[3， 5-6] ， 均会使活性氧（reactive oxygen species， ROS）含量增加。而ROS的过量积累诱导氧化损伤，对机体产生包括生物膜脂过氧化、DNA 损伤、蛋白质变性等毒害效应[7]；对机体造成冷害的二次反应，使细胞膜结构由相变成为刚变[5]。菠萝由于田间或采后的长时间低温冷害，使细胞膜出现不可逆的渗透性损伤，打破膜质区域化划分，导致质体内的多酚氧化酶（polyphenol oxidase， PPO）与液泡内的酚类底物均释放到细胞质中，接触氧形成化醌类物质，引起果肉褐变[3， 8]。

为了维持自身ROS 的动态平衡，植物进化出一系列酶促和非酶促抗氧化防御系统[9]。非酶促抗氧化系统包括抗坏血酸（ascorbic acid， AsA）、还原型谷胱甘肽（lglutathione， GSH）等抗氧化物质，而酶促抗氧化清除系统则包括抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase， APX）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase， GPX）等抗氧化蛋白酶[10-11] ， 其分別属于水循环系统、AsA-GSH 循环系统和GPX 循环系统， 其中AsA-GSH 循环系统在抗氧化防御中发挥着主要作用[12]。本课题组前期用抗氧化剂AsA 处理采后‘巴厘菠萝，发现AsA 能显著减少机体内H₂O₂含量、膜受损伤程度和PPO 活性，增强抗氧化防御系统关键抗氧化物酶活性，增加菠萝的抗氧化能力，使ROS 毒害效应减弱，显著降低菠萝黑心病病情指数，延缓黑心病的发生[13-14]，但AsA 在其中的发生机制尚不明确。APX 作为AsA-GSH循环系统的关键调节酶，以AsA 为电子供体，将H₂O₂转换为H₂O，清除机体过量ROS，达到维持ROS 稳态的目的[15]。前人研究发现APX 通过清除植物体内的H₂O₂参与植物的多种发育生理过程和胁迫反应，如，ZHANG 等[16]研究表明，过表达OsAPX2 可以清除活性氧，提高水稻幼苗对干旱、盐和低温胁迫的耐受性；ZHANG 等[17]发现异源表达金孢隐霉菌CfAPX 降低了转基因拟南芥H₂O₂含量，具有较强的胁迫耐受性；CAVERZAN 等[18]研究表明chlAPXs 参与水稻光氧化胁迫下的光合作用和保护的调控作用。

本研究从菠萝基因组数据库中（ https：//phytozome-next.jgi.doe.govinfo/Acomosus_v3）[19]筛选到6 个APX 基因，对黑心病发生过程以及抗坏血酸处理后的转录水平变化进行分析，发现抗坏血酸处理显著增强AcAPX1 基因的表达，相关性分析发现， AsA 处理后菠萝黑心病指数与AcAPX1 基因表达水平呈显著正相关，因此，猜想AcAPX1 基因在AsA 延缓黑心病恶化中发挥重要作用。为探究其作用机制，进一步克隆AcAPX1基因，并对该基因进行氨基酸理化性质、同源氨基酸比对、进化树构建、功能结构域分析以及亚细胞定位等一系列生物信息学分析，为探究菠萝AcAPX1 基因参与AsA 清除ROS，延缓黑心病恶化的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选取菠萝栽培品种‘巴厘（Ananas comosus L.cv. Comte de Paris）为试验材料，样本采收于中国热带农业科学院南亚热带作物研究所菠萝种植基地（21°10′2′′N， 110°16′34′′E）。抗坏血酸（AsA），纯度99%，购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 采后处理方法和RNA 提取 挑选无病虫害、无机械损伤，果实大小一致的六成熟果60 个，用0.5 mg/L 咪鲜胺浸泡果实底部1 min，置阴凉通风处晾干备用。各取30 个果，分别用清水和0.2% AsA 水溶液浸泡果实底部15 min，待风干后，置于（25±2） ℃贮藏箱中，分别于贮藏0、3、6、9、12 d 时取F/C 处果肉，取样方式、具体位置以及黑心病指数参考侯晓婉等[13-14]的方法，液氮冷冻后，研磨，用Quick RNA isolation Kit（北京华越洋生物技术有限公司）快速通用植物RNA提取试剂盒提取RNA，并选用TransStart? TopGreen qPCR SuperMix 试剂盒反转录合成cDNA，置于–20 ℃冰箱备用。

1.2.2 菠萝APX 基因转录水平分析 从菠萝基因组数据库（ https：//phytozome-next.jgi.doe.govinfo/Acomosus_v3）[19]获得菠萝APX 基因序列，利用NCBI Primer designing tool （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/）进行定量引物设计（表1），通过全式金TransStart? Tip Green qPCRSuperMix 试剂盒进行荧光定量PCR 反应，其中，反应体系为20 μL，cDNA 模板1 μL，引物F（10 μmol/L）和R（10 μmol/L）均为0.4 μL，2×TransStart? Top Green qPCR SuperMix 10 μL，Prssive Reference Dye （50×） 0.4 μL，无菌去离子水7.8 μL。在Roche LightCycler^?96 荧光定量仪中进行扩增反应，反应程序如下：预变性95 ℃ 30 s，循环反应：变性94 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，40 个循环，溶解曲线：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。每个样品设置3 个重复，相对表达量采用2?ΔΔCT法进行分析。

1.2.3 AcAPX1 基因的克隆 从菠萝基因组数据库获得菠萝AcAPX1 蛋白序列及基因序列，运用Primer 5.0 软件设计AcAPX1 基因编码（codingsequence， CDS）全长序列克隆引物（表1）。使用TransStart? FastPfu DNA Polymerase 试剂盒对AcAPX1 基因CDS 全长序列进行扩增，PCR 扩增体系及反应条件如下：总体系50 μL，模板1 μL，引物F（10 μmol/L）和R（10 μmol/L）均为1 μL，5×TransStartd? FastPfu Buffer 10 μL ， NTP（2.5 mmol/L）4 μL，TransStart? FastPfu DNAPolymerase 1 μL， ddH2O 32 μL， 94 ℃ 预变性4 min；94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃延伸7 min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，切胶回收纯化，连接至T1 载体，转化DH5α 感受态细胞，在37 ℃的恒温培养箱过夜培养，并进行蓝白斑筛选，挑选白色的阳性克隆菌斑后通过PCR 筛选分析，并送菌液进行测序。

1.2.4 AcAPX1 基因生物信息学分析 利用NCBI的ORF（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在线软件对AcAPX1 基因开放阅读框进行分析；运用NCBI 在线搜索AcAPX1 在不同物种中的同源蛋白序列；通过Conserved domains 在线软件（ https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对AcAPX1 蛋白进行保守结构域预测；通过ExPASy-ProtParam在线软件（https：//web.expasy.org/ protparam/）对AcAPX1 蛋白的理化性质进行分析；利用GSDS 2.0 在线软件（http：//gsds.gaolab.org/）分析AcAPX1 基因结构；使用DNAMANv.8.0 软件对不同物种间的氨基酸序列进行比对；利用MEGA6 软件进行系统进化树构建；利用在线软件InterProScan （ https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）预测AcAPX1 蛋白的结构特征；利用SOPMA 在线软件（https：// npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html）预测蛋白质二级结构；用SWISS-MODEL 在线软件（ https：//www.swissmodel.expasy.org/）预测AcAPX1 蛋白三级结构；通过在线软件SignalP（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行蛋白的信号肽预测；使用在线分析软件TMHMM v2.0（ http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/）预测序列的跨膜螺旋结构域；运用Cell-PLoc 2.0 在线预测软件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc- 2/）对AcAPX1 蛋白进行亚细胞定位分析[20]。

1.3 数据处理

采用Graphpad prism 9.0 软件对数据进行方差分析和相关性分析，采用Excel 软件制表[21]。

2 结果与分析

2.1 菠萝RNA 的提取和反转录cDNA

提取菠萝果肉（F/S）总RNA，经电泳鉴定RNA 条带完整（图1），用核酸测定仪器测得其OD260/280 在1.6～1.8 之间，可用于反转录实验。

2.2 菠萝 APX 基因转录水平变化及其与黑心病指数的相关性前期研究发现AsA 延缓了黑心病的恶化，通过RT-qPCR 对采后貯藏0、3、6、9、12 d 的APX基因转录水平进行分析，结果显示，6 个AcAPX基因均不同程度响应AsA 处理（图2），表明APX以AsA 为电子供体，参与菠萝的抗氧化过程，在延缓黑心病的恶化中发挥一定作用。在各个贮藏阶段，AcAPX3、AcAPX5 基因在CK 和AsA 处理组中的表达整体变化趋势一致，均持续下降，并且均在9 d 时，CK 与处理组有显著差异；AcAPX2、AcAPX4 和AcAPX6 在贮藏初期显著上调，3 d 后其表达呈下降趋势；此外，处理组与CK间AcAPX2和AcAPX6 无显著差异；而AsA 处理后AcAPX4在3 d 时极显著下降，下降时间点从CK 组的6 d提前到3 d，表明AsA 处理提前了AcAPX4 对黑心病的响应时间。AcAPX1 在AsA 处理组和CK中的表达趋势呈显著差异，AsA 处理后AcAPX1基因呈持续上升的表达趋势；而CK 中在贮藏初期上调后，随着贮藏时间的延长，其表达量无显著差异。

为了进一步筛选显著响应AsA 延缓黑心病发生的关键基因，进行黑心病指数与AcAPXs 基因表达量的相关性分析（表2），结果表明，CK 中，AcAPX5 基因对菠萝黑心病指数的影响最大，相关系数为–0.9348，呈显著负相关（P<0.05），而与其他基因无显著相关。AsA 处理组中，AcAPX1、AcAPX5 和AcAPX6 基因对菠萝黑心病指数的影响较大，其相关系数分别为0.9362、–0.9142 和–0.8998，其中，与AcAPX5 和AcAPX6 基因呈显著负相关（P<0.05），与AcAPX1 基因呈显著正相关（P<0.05），与AcAPX1 基因的相关系数更接近1，说明与黑心病指数的相关性更大；并且贮藏后期AcAPX1 基因的表达极显著高于CK。综上表明，AcAPX1 基因显著响应AsA 处理，可能在AsA 延缓黑心病的发生中发挥重要作用。

2.3 菠萝AcAPX1 基因的克隆及编码蛋白质的理化性质

以未处理的‘巴厘菠萝果肉的cDNA 为模板，使用AcAPX1-F、AcAPX1-R 特異性引物，运用RT-PCR 扩增AcAPX1 基因的CDS 全长（图3）。通过BLAST 比对发现，扩增片段包含完整的CDS 序列，全长为753 bp，编码250 个氨基酸残基（图4）。AcAPX1 编码的蛋白分子量大小为27.410 87 kDa，分子式为C1220H1880N338O367S8，理论等电点为5.52，该蛋白有36 个带负电荷的氨基酸残基（Asp+Glu），28 个带正电荷的氨基酸残基（Arg+Lys），蛋白质半衰期为30 h。菠萝AcAPX1基因编码的蛋白质不稳定系数为39.87（<40），表明该蛋白为稳定蛋白；平均亲水性常数为-0.436，说明该蛋白为亲水性蛋白，脂溶指数为72.68，其氨基酸组成如表3 所示。运用GSDS 2.0 分析AcAPX1 基因结构表明，该基因含有5′UTR 和3′UTR，9 个外显子和8 个内含子（图5）。

2.4 菠萝AcAPX1 蛋白功能结构域分析及同源氨基酸序列比对

利用NCBI Conserved Domain Search 寻找AcAPX1 蛋白的保守区，发现其含有APX 蛋白家族的保守序列，表明该蛋白属于植物过氧化物酶（POD）超家族，并且具有血红素结合位点、K+结合位点及底物结合位点（图6）。通过NCBI 的Blast 工具对AcAPX1 氨基酸序列进行比对，结果表明，菠萝AcAPX1 与番木瓜、香蕉、椰子、油棕等热带植物的序列相似性达85%以上（图7）。结合保守结构域分析可得，AcAPX1 基因编码的蛋白除了含有植物POD 结构域，还含有XANX、LPDAX 等保守片段（图7 红色方框区域），这些片段是APX 与底物AsA 结合的关键。

2.5 系统发育树构建

采用Construct/Test Neighbor-Jouning Tree，Bootstrap 值为1000，利用MEGA6 和Clustalx 软件构建无根系统发育树，进化树整体分为三大类（图8），结果表明，菠萝AcAPX1 与油棕EgAPX、椰子CnAPX 和海枣PdAPX 分为一组，表明菠萝与热带植物的亲缘关系较近。

2.6 蛋白质二级结构、三级结构、信号肽预测和跨膜结构域分析

通过SOPMA 在线软件预测AcAPX1 蛋白质二级结构，结果表明，α-螺旋有103 个，占比为41.20%，无规则卷曲有93 个，占比为37.20%，延伸链有32 个，占比为12.80%，β-转角有22 个，占比为8.8%（图9A）。用SWISS-MODEL 在线软件预测其蛋白三级结构（图9B）。利用TMHMMServer v.2.0 和SignalIP4.1Server 在线软件分别检测AcAPX1 蛋白质的蛋白跨膜结构域和跨膜结构域，分析表明其蛋白无跨膜螺旋结构域（图9C），也无信号肽（图9D）。

2.7 亚细胞结构

通过Cell-PLoc 2.0 在线预测软件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）对AcAPX1蛋白进行分析，发现该蛋白可能存在于细胞质中。结合该蛋白无跨膜结构域，加大了其定位在细胞质的可能性。

3 讨论

近年来，APX 基因的功能在水稻、拟南芥和玉米等植物中被广泛报道，APX 基因具有响应各种非生物胁迫，增强植株抗氧化能力的功能。拟南芥、水稻缺乏APX 基因时，会造成H₂O₂含量升高，引起ROS 的过量积累，对机体造成氧化损伤，对生物大分子产生毒害效应，甚至导致细胞死亡[7]，降低植株抵御胁迫的能力[22-24]；过表达APX增强了水稻、拟南芥等植物的APX 酶活性，具有高效的ROS 清除性，提高了植株对干旱[15-16]、低温[16]、重金属[23]和盐[25]等胁迫的耐受性。

菠萝黑心病是一种长时间低温冷害导致的生理失调症。长期低温冷害造成机体产生过量的ROS，引起膜损伤，使得质体内的PPO 与液泡内的酚类底物接触氧化形成醌类物质。通过RTq-PCR 分析发现，AcAPX1-6 基因均响应黑心病的发生。AsA 处理延缓黑心病的恶化后，改变了AcAPX1-6 基因的表达。特别是AcAPX1 基因，在AsA 处理后，其表达显著上调，并且黑心病指数与AcAPX1 基因表达水平呈显著正相关。AsA处理后，可能通过上调AcAPX1 的表达来延缓黑心病的发生。基于RTq-PCR 和相关性分析结果，从‘巴厘菠萝中成功克隆到AcAPX1 基因，分析表明该基因编码的蛋白质与其他物种APX 蛋白具有相同的保守结构域，具有AsA 结合位点、血红素结合位点、K+结合位点，属于POD 超家族，在清除ROS 和植物抵抗外界胁迫中发挥重要作用；系统发育树分析表明，菠萝AcAPX1 与油棕、椰子等热带植物的亲缘关系较近；AcAPX1 蛋白为亲水性蛋白，并且不含跨膜结构和信号肽，亚细胞定位预测其定位于细胞质中。

本研究结果为探究菠萝AcAPX1 基因的功能及抗氧化机理奠定了基础。下一步将构建过表达载体，通过转基因技术进一步研究该基因在抗氧化方面中的具体作用，解析AcAPX1 基因在AsA延缓菠萝黑心病恶化中发挥的作用机制。