龚倩梅,刘永仕,袁何玲,吕茜,王晓明,黄金虎,王丽平

(南京农业大学动物医学院,江苏 南京 210095)

肝脏是机体负责消化、吸收、代谢和营养物质合成与储存的重要器官,又是最重要的解毒器官,易受病毒、药物、毒物等的损害而导致损伤,对人和动物的健康造成极大影响[1]。长期摄入高脂、高蛋白食物导致机体糖、脂代谢异常和胰岛素抵抗而引发人和动物的代谢相关脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease,MAFLD)在全球发病率极高,已成为人和动物健康的“隐性杀手”[2-4]。据最新统计,我国患MAFLD的人口大约占全国人口的29.2%,已成为最常见的肝脏疾病[5]。犬科动物和猫科动物的肥胖率也已达到大流行程度,全球超重和肥胖的成年猫和犬可分别达25%～35%和35%～40%,肥胖导致猫犬代谢紊乱引起脂肪肝病[3,6]。在畜禽养殖过程中,感染大肠杆菌等病原、长期摄入霉变饲料、使用药物不当等均会引起畜禽的急性肝损伤发生,可致生产性能下降,给养殖业造成巨大经济损失[7]。宠物临床中犬猫等也常出现因误食有毒物质、治疗药物的副作用和病毒感染等导致急性肝损伤影响动物健康甚至危及生命[8]。目前肝脏疾病已成为临床常见疾病之一,因此寻找和研发相关保肝药物或者饲料添加剂预防肝损伤的发生和发展对保障动物健康具有重要意义。

大蒜辣素最初是由Cavallito等[9-10]从碾碎的大蒜中分离得到的一种含硫有机化合物,是大蒜中的主要有效成分。随后大蒜辣素被证明具有多种药理活性,如抗炎、抗氧化等作用[11]。研究证实H2S容易穿透过磷脂膜及红细胞进入细胞内与一些膜内硫基化合物相互作用,通过非特性作用发挥其药理活性[12]。外源性给予H2S供体能激活Nrf2通路导致机体的抗氧化、抗炎活性增强,改善不同因素导致的肝损伤[13]。研究表明大蒜辣素进入体内代谢后可产生H2S[14],推测大蒜辣素可作为H2S的供体而间接发挥药理学作用。目前,有关大蒜辣素对肝损伤的缓解作用及其机制的研究甚少。我们前期的研究结果显示,肉鸡日粮中添加蒜粉后可降低肉鸡脂肪肝的发生率,提示其对非酒精性肝病也有一定的预防和干预作用。因此,本研究拟通过CCl4诱导小鼠急性肝损伤模型进一步探索大蒜辣素对损伤的逆转作用及其潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物

6～7周龄SPF级Balb/c雄性小鼠,体重18～22 g,共42只,购自集萃药康有限公司。小鼠饲养于(23±2)℃,相对湿度为(50±10)%的环境中,光照时间为12 h,自由采食和饮水。

1.2 主要试剂与仪器

大蒜辣素(新疆医科大学提供),纯度1.603%;四氯化碳(上海麦克林生物科技有限公司),纯度≥98%;复方甘草酸苷片(甘毓)(CGI,每片含甘草酸苷25 mg、甘氨酸25 mg、DL-甲硫氨酸25 mg)(北京凯因科技股份有限公司);丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)活性测定试剂盒(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司);蛋白酶抑制剂Cocktail(美国Bimake生物科技有限公司);NC膜(Millipore);白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)ELISA检测试剂盒(Proteintech);丙二醛(MDA)和过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(索莱宝);BCA 蛋白检测试剂盒(南京诺唯赞生物技术有限公司);核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、NAD(P)H:醌氧化还原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1]和β-actin单克隆抗体(Abcam),含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase 3)、Caspase 9、B淋巴细胞瘤2相关X蛋白(B cell lymphoma 2 associated X,Bax)(Abmart)。

全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司);Tanon 4600SF全自动数码凝胶/化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司);垂直电泳仪、转印仪(Bio-Rad);多样品组织匀浆机(Tissuelyser)。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分组及处理将42只Balb/c小鼠适应性饲养1周后随机分为7组。分组和处理情况如表1所示。在CCl4处理48 h后每组小鼠称重,眼球摘除法采血后立刻颈椎脱臼处死,取肝脏组织,称重;用预冷的生理盐水清洗,一部分组织于4%多聚甲醛通用型组织固定液中固定,一部分置于液氮中保存。

1.3.2 肝脏组织病理学观察每只小鼠取肝脏同一部位样品于组织固定液中固定24 h 后进行脱水透明,再用石蜡进行包埋、制片,苏木素-伊红(HE)染色后于显微镜下观察。

表1 小鼠分组和处理Table 1 Grouping and treatment of mice

1.3.3 血清ALT、ALP及AST活性的检测眼球采血,于室温下放置0.5 h后置于4 ℃冰箱过夜,4 ℃、3 000 r·min-1离心5 min后获得血清。使用全自动生化分析仪检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)及天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性。

1.3.4 肝组织中MDA含量和CAT活性的测定称取0.1 g肝脏于1 mL组织提取液中,然后用多样品组织匀浆机以60 Hz匀浆20 s,4 ℃、10 000 r·min-1离心10 min,取上清液按试剂盒说明书测定丙二醛(MDA)含量和过氧化氢酶(CAT)活性。

1.3.5 血清炎性因子检测按照试剂盒说明书步骤,用ELISA法检测血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。方法如下:将血清样品加入酶标板,37 ℃湿盒孵育120 min;洗涤液洗板4次后加入相应检测抗体,37 ℃湿盒孵育60 min;洗涤液洗板4次后加入HRP抗体,37 ℃湿盒孵育40 min;洗涤液洗板4次后加入显色液,37 ℃避光显色15 min,终止显色,测定各孔吸光值(A450),根据标准曲线计算每个样品的浓度。

1.3.6 Western blot测定凋亡相关蛋白的表达将研磨后的肝脏组织置于预冷的裂解液,于多样品组织匀浆机中以60 Hz 频率匀浆20 s,冰上放置5 min以确保完全裂解。4 ℃、12 000 r·min-1离心20 min,取上清液,得总蛋白。用BCA法测定蛋白浓度,将蛋白质量浓度定量为4 mg·mL-1,配制120 g·L-1SDS-PAGE胶;样本点样量为10 μL,采用半干转印法将蛋白转印NC膜,以50 g·L-1脱脂奶室温封闭2 h,加一抗 4 ℃孵育过夜;TBST洗膜后加二抗,反应2 h,洗涤后加入ECL发光液,曝光。

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 大蒜辣素对CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织病理学的影响

正常小鼠肝脏为棕褐色,质地柔软,肝细胞排列规则、致密,核圆居中(图1-A和1-a)。大蒜辣素单独处理未引起小鼠肝脏发生病理变化(图1-B和1-b)。CCl4处理组小鼠肝脏呈土黄色,肝脏包膜紧张,边缘钝圆肿胀。病理切片显示肝脏出现部分坏死,肝细胞体积增大、肿胀,细胞之间界限不清,胞浆中出现大小不等的空泡(脂肪滴),细胞核皱缩(图1-C和1-c)。

小鼠给予不同剂量的大蒜辣素(40、20和10 mg·kg-1)和复方甘草酸苷连续治疗2 d,各治疗组小鼠肝脏趋于正常,肝脏颜色逐渐呈现鲜红(图1-D—G),病理切片(图1-d—g)显示大蒜辣素不同剂量处理组和复方甘草酸苷处理组小鼠肝脏坏死区域减少,胞浆圆形空泡也显著减少。

2.2 大蒜辣素对CCl4致急性肝损伤小鼠肝功能指标的影响

如图2所示:CCl4组小鼠血清AST、ALT及ALP活性均极显著高于空白对照组及大蒜辣素对照组小鼠(P<0.01)。不同剂量大蒜辣素均能显著降低小鼠血清AST、ALT及ALP的活性(P<0.05),且呈浓度依赖性。与复方甘草酸苷组相比,大蒜辣素对肝损伤小鼠的保护作用更佳,表现为其可更显著降低AST和ALT活性的作用(P<0.05)。大蒜辣素不同剂量组之间差异不显著(P>0.05)。肝功能指标的结果提示,大蒜辣素对小鼠CCl4急性肝损伤具有一定的缓解作用。

图1 大蒜辣素对急性肝损伤小鼠肝脏外观(上)及组织(下)病理学的影响Fig.1 Effects of allicin on liver appearance(upper)and histopathology(lower)in mice with acute liver injuryA/a.空白组 Control;B/b.大蒜辣素对照组 Allicin control;C/c.CCl4组 CCl4 group;D/d.大蒜辣素40 mg·kg-1 Allicin 40 mg·kg-1;E/e.大蒜辣素20 mg·kg-1Allicin 20 mg·kg-1;F/f.大蒜辣素10 mg·kg-1Allicin 10 mg·kg-1;G/g.复方甘草酸苷(80 mg·kg-1)Compound glycyrrhizin(80 mg·kg-1). 标尺=50 μm Bar=50 μm.

图2 大蒜辣素对急性肝损伤小鼠肝功能酶活性的影响(n=6)Fig.2 Effects of allicin on liver function enzyme activity in mice with acute liver injury(n=6)1)AST:天冬氨酸氨基转移酶 Aspartate aminotransferasee;ALT:丙氨酸氨基转移酶Alanine aminotransferase;ALP:碱性磷酸酶 Alkaline phosphatase. 2)不同大、小写字母分别表示差异极显著(P<0.01)和差异显著(P<0.05)。下同。Different large and small letters indicate significant differences at 0.01 and 0.05 levels,respectively. The same below.

图3 大蒜辣素对急性肝损伤小鼠血清炎性因子水平的影响(n=6)Fig.3 Effects of allicin on serum inflammatory factors in mice with acute liver injury(n=6)TNF-α:肿瘤坏死因子αTumour necrosis factor α;IL-1β:白介素1βInterleukin 1β;IL-6:白介素6Interleukin 6.

2.3 大蒜辣素对CCl4致急性肝损伤小鼠炎性因子水平的影响

各组小鼠血清中3种主要炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平如图3所示。CCl4组小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均极显著高于空白对照组及大蒜辣素对照组小鼠(P<0.01),显示CCl4引起肝脏损伤,导致炎性因子大量产生。高剂量(40 mg·kg-1)大蒜辣素灌胃2 d后,可极显著降低小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平(P<0.01),且高剂量大蒜辣素对小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平的降低作用显著优于复方甘草酸苷组(P<0.01);中剂量大蒜辣素(20 mg·kg-1)可极显著降低小鼠血清TNF-α水平(P<0.01),但对小鼠血清 IL-6 和IL-1β的生成无显著影响(P>0.05);低剂量大蒜辣素(10 mg·kg-1)对小鼠血清TNF-α、IL-1β和 IL-6 的生成无显著影响(P>0.05),与高剂量组之间差异极显著(P<0.01)。

2.4 大蒜辣素对CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织MDA含量和CAT活性的影响

图4结果显示,CCl4引起小鼠肝脏损伤后可导致MDA含量极显著升高(P<0.01),CAT活性极显著下降(P<0.01)。不同剂量的大蒜辣素能显著降低小鼠肝脏组织中MDA含量(P<0.01,P<0.05),呈一定的剂量依赖性,且高剂量大蒜辣素效果优于复方甘草酸苷(P<0.01)。此外,不同剂量的大蒜辣素和复方甘草酸苷均可在CCl4致肝损伤情况下极显著提高肝脏中CAT活性(P<0.01),呈现较好的抗氧化作用。

图4 大蒜辣素对急性肝损伤小鼠丙二醛(MDA)含量及过氧化氢酶(CAT)活性的影响(n=6)Fig.4 Effects of allicin on the content of MDA and CAT activity in mice with acute liver injury(n=6)

图5 大蒜辣素对CCl4诱导的小鼠肝细胞凋亡相关蛋白表达的影响(n=6)Fig.5 Effects of allicin on CCl4-induced the expression of hepatocyte apoptosis related protein in mice(n=6)Bax:B淋巴细胞瘤2相关X蛋白 B cell lymphoma 2 associated X;Cleaved-Caspase 3:裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3;Cleaved-Caspase 9:裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9 Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 9.

2.5 大蒜辣素对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤肝细胞凋亡的影响

如图5所示:采用Western blot检测肝脏组织中Caspase 3、Caspase 9及Bax的表达情况,发现CCl4组小鼠肝脏组织中 Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9及Bax等凋亡相关蛋白的相对表达水平均极显著高于空白对照组和大蒜辣素对照组小鼠的表达量(P<0.01),Cleaved-Caspase 3和Bax蛋白水平较空白对照组增加约3倍,表明CCl4可引起肝细胞凋亡。灌胃高、中和低剂量的大蒜辣素后,小鼠肝脏组织中Cleaved-Caspase 3和Cleaved-Caspase 9蛋白表达量均显著降低(P<0.05),并存在较好的剂量-效应关系;且高、中剂量的大蒜辣素还可显著降低CCl4处理小鼠肝脏组织中Bax蛋白表达量(P<0.05)。80 mg·kg-1复方甘草酸苷也显著降低Cleaved-Caspase 3和Cleaved-Caspase 9和Bax蛋白的表达量(P<0.01),作用与大蒜辣素相当。

2.6 大蒜辣素对CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织Nrf2和NQO1蛋白表达的影响

Western blot检测肝脏组织中Nrf2和NQO1的蛋白表达情况如图6所示。CCl4可导致肝组织中Nrf2和NQO1蛋白水平显著下降。高、中剂量大蒜辣素能显著增加Nrf2蛋白表达水平,约为CCl4组的2倍(P<0.01),但高、中剂量组之间无显著差异。高剂量大蒜辣素还可显著增加NQO1蛋白的表达水平(P<0.01),约为CCl4组的2倍,但中、低剂量大蒜辣素对NQO1蛋白的表达水平无显著影响(P>0.05)。复方甘草酸苷对小鼠肝组织中Nrf2和NQO1蛋白表达水平均未产生显著影响(P>0.05),效果劣于高、中剂量的大蒜辣素(P<0.05)。

图6 大蒜辣素对急性肝损伤小鼠肝组织Nrf2和NQO1蛋白表达的影响(n=6)Fig.6 Effects of allicin on Nrf2 and NQO1 protein expression in mice liver with CCl4 acute liver injury(n=6)Nrf2:核因子E2相关因子2 Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2;NQO1:NAD(P)H∶醌氧化还原酶1 NAD(P)H∶quinone oxidoreductase 1.

3 讨论

CCl4通过直接或间接刺激肝细胞导致肝细胞损伤,与人发生的急性肝损伤非常相似[15-16]。CCl4诱导小鼠急性肝损伤已被广泛用作评估肝毒性和开发肝脏药物的经典动物模型。本研究采用高浓度CCl4处理小鼠后也导致小鼠出现严重的肝脏损伤,并发现大蒜辣素呈剂量依赖性地缓解了CCl4诱导的肝脏病理损伤,显著降低小鼠血清转氨酶活性,表明大蒜辣素对CCl4诱导的急性肝损伤具有一定的修复作用。

CCl4进入肝细胞,被细胞色素P450代谢为三氯甲基自由基和三氯甲基过氧自由基后,不可逆性地与肝组织中的大分子如脂质、蛋白质和核酸等结合,从而引发脂质过氧化并破坏其结构和功能[17-18]。自由基等促氧化剂和抗氧化剂之间的不平衡会导致氧化应激,故有效抑制氧化应激则可以控制肝损伤的进展[19]。MDA是氧自由基与细胞膜表面不饱和脂肪酸反应的产物,检测MDA含量常常可以反映机体内脂质过氧化的程度,间接反映细胞损伤的程度[20]。从本研究中发现,用CCl4造模8 h后给以大蒜辣素处理可显著减少小鼠MDA的产生量,表明大蒜辣素可缓解CCl4引发的脂质过氧化而减缓肝损伤的进展。

研究已证明Nrf2信号通路可通过调节抗氧化相关酶(如NQO1、CAT等)的靶基因活性,进而维持机体的氧化还原稳态和减少氧化应激[21]。在CCl4引起肝损伤发展阶段,肝脏CAT活性也会随着肝损伤的进展而降低[22]。NQO1是一种抗氧化酶,通过单步双电子还原反应催化醌还原成氢醌,促进醌的排泄,以减少机体中ROS的形成,从而阻止有害物质对DNA造成氧化损伤。此外,NQO1通过维持泛醌和α-生育酚醌的还原形式,在保护内源性抗氧化剂中起重要作用[23]。CAT是动物体内重要的内源性抗氧化剂之一,具有强烈的抗氧化特性,可以缓解动物由于氧化应激所造成的机体或功能损伤,其能够增强机体对羟基自由基及超氧阴离子的抑制能力,并且可以显著减少MDA含量[24-25]。本研究发现CCl4处理小鼠8 h后若及时给予大蒜辣素,可提高肝脏组织中Nrf2和NQO1蛋白的表达水平及肝脏中CAT活性,此结果表明大蒜辣素可能通过提高Nrf2的表达水平,从而促进NQO1、CAT等抗氧化酶的表达,进而减少肝脏MDA的生成,缓解CCl4对肝脏的氧化应激损伤。

图7 大蒜辣素缓解CCl4急性肝损伤作用示意图Fig.7 Schematic diagram of allicin onCCl4 acute liver injury

此外,研究表明过度氧化应激可诱导肝细胞凋亡[26]。本研究还发现大蒜辣素可降低CCl4诱导Caspase 9、Caspase 3和Bax高量表达引起肝细胞凋亡,由此可见大蒜辣素可通过抗氧化和抗凋亡作用缓解CCl4诱导的急性肝损伤。越来越多的研究表明,CCl4引发的氧化应激直接导致肝细胞坏死和凋亡,释放损伤相关分子模式。这些相关分子模式通过模式识别受体激活肝脏中的固有免疫细胞,产生促炎症介质,如TNF-α、IL-1β和IL-6,并促进炎症反应,进而加重急性肝损伤[19,27-28]。为了研究大蒜辣素对CCl4诱导的急性肝损伤的治疗性解毒作用是否与抑制促炎细胞因子有关,本试验采用ELISA法检测肝脏中TNF-α、IL-1β和IL-6水平,结果显示,大蒜辣素给药治疗后,可抑制CCl4诱导的促炎细胞因子的产生,最终减轻肝脏炎症反应。本试验采用的是急性肝损伤模型,后续我们会继续在慢性肝损伤模型和畜禽中开展相关研究。

综上所述,大蒜辣素通过调节氧化应激、炎症和细胞凋亡进而缓解CCl4诱导的急性肝损伤,其作用靶点和途径如图7所示。该研究为大蒜辣素在急性肝损伤和NAFLD临床治疗中的应用提供了试验依据。