刘慧莉, 陈 垣, 郭凤霞, 周 洋, 成志强

(1.甘肃农业大学农学院,生命科学技术学院,甘肃省干旱生境作物学重点实验室,甘肃省中药材规范化生产技术创新重点实验室,甘肃省药用植物栽培育种工程研究中心, 兰州 730070;2.平凉市关山林业管理局, 甘肃 平凉 744100)

党参[Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.]为桔梗科(Campanulaceae)党参属多年生草本植物,以干燥根入药,具有健脾益肺,养血生津的功效[1],是我国常用的补益药之一。甘肃党参的种植面积占全国党参种植面积的90%左右,于2012年陇西白条党参获中国国家地理标志产品(国家市场监督管理局,商标号4891422)[2-3]。党参种质资源丰富,近缘品种较多。近年来,由于品种间的相互引种、调种,使得种质资源混乱,群体间生物学混杂,这不仅影响种子的质量也影响药材的产量和品质。

党参以种子繁殖,研究其开花习性、花部特征、花粉活力、柱头可受性等对育种和种子生产具有重要意义。有性生殖过程中,植物的生物学特性与其传粉机制相适应,大量有活力的花粉、有效的传媒和可授期的柱头是植物生殖成功的前提,繁育系统直接影响后代遗传组成,其中交配系统是核心[4]。已有学者对暗紫贝母[5]、菘蓝[6-7]、直缘乌头[8]、黄莲花[9]等药用植物的繁育系统进行了深入的研究,为药用植物育种提供了科学依据。本研究从开花动态、花粉活力、柱头可授性、人工授粉和套袋试验等方面研究党参的繁育系统,为党参品种选育及优良品种的提纯复壮提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况与试验材料

试验地位于甘肃省陇西县首阳镇陇西药铺园(35°5′22″N,104°24′44″E),海拔1 912 m,年均气温7.7 ℃,年均降水量450 mm,降水集中在8—9月,年均日照时数292 h,年均无霜期142 d,土壤质地为黄绵土。

本试验材料为甘肃农业大学选育的新品系两年生健康、无病虫害的植株“甘党1号”。

1.2 开花动态观察

观察党参花的形态特征并且在党参整个生殖生长期内参照王艳芳[11]的方法观察党参花期,划取3个3 m×3 m样方,观测记录各小区内党参开花动态,试验于7月20日开始,每10天观测一次,按表1标准记录。在盛花初期,选取一定数量即将开花的花朵进行挂牌标记,每隔2 h观察一次,记录其开花状态及柱头与雄蕊位置变化情况。根据观察结果将党参花划分等级。

表1 党参开花进程Table 1 The flowering process of Codonopsis pilosula

1.3 花粉活力测定

采用0.5%TTC(2,3,5-氯代三苯基四氮唑)法测定其花粉的活力。选取各等级的花朵,用镊子小心夹取每朵花中的花药,分别置于载玻片上,并用镊子捣碎花药散出花粉,加1～2滴配制好的TTC溶液,盖上盖玻片,放置在室温且黑暗处10～15 min,随后置于光学显微镜下观察花粉粒的染色情况。根据花粉染色情况判定花粉的活力,花粉粒被染为红色,表明花粉活力最强;淡粉色表明花粉活力次之;无色或绿色时表明花粉无活力。每一等级花选取3朵进行观察,每次观察5个视野并统计视野内花粉粒总数以及红色、淡粉色花粉粒数目,最后计算不同级别花朵的花粉活率。

花粉活率/%=[(红色花粉粒数+淡粉色花粉粒数)/花粉粒总数]×100%;

强活力花粉率/%=(红色花粉粒数/花粉粒总数)×100%;

弱活力花粉率/%=(淡粉色花粉粒数/花粉粒总数)×100%。

1.4 柱头可受性测定

参照Dafni等[10]的方法(联苯胺-过氧化氢法)测定柱头可受性。用镊子小心摘取各等级花的柱头并放置于单凹面载玻片上,将含有联苯胺-过氧化氢的反应液(1%联苯胺∶3%过氧化氢∶水=4∶11∶22)滴在柱头上,使柱头浸在反应液中,随后将载玻片置于光学显微镜下观察柱头周围产生气泡的数量与速度,气泡越多、速度越快说明柱头的可受性越强,反之柱头可受性越低,没有气泡产生则表明该阶段的柱头不具有可受性。每一等级选取3个花朵进行观测,每一装片观察统计5个视野。

1.5 传粉方式研究

在盛花期对党参花做以下9个处理:

1) 自然授粉:不去雄,不套袋,仅挂牌标记,检测自然条件下果实的结实率;

2) 不去雄套纸袋:在花冠还未裂开时套纸袋,检测其自交结实情况;

3) 去雄套纸袋:选花萼将要裂开、但花药未裂的花朵,去掉雄蕊,并套上纸袋,检测是否具有融合生殖;

4) 去雄套网袋:选花药未裂开的花朵,去掉雄蕊并套上网袋,检测风媒传粉的结实率;

5) 去雄不套袋:去掉未裂开的雄蕊,检测异花授粉的结实率;

6) 去雄同株异花外壁授粉:去掉还未裂开的雄蕊,取同一植株上的另一朵花药刚裂开的雄蕊,将花药涂抹在柱头外壁上,检测外壁和同株授粉情况;

7) 去雄异株异花外壁授粉:去雄后选取另一植株上刚裂开的花药进行授粉,检测外壁和异株授粉情况;

8) 去雄同株异花内壁授粉:取掉雄蕊后套袋,待柱头裂开后,取同株花药裂开的雄蕊,将花粉授在柱头的内壁,随后继续套上纸袋,检测内壁和同株授粉情况;

9) 去雄异株异花内壁授粉:操作步骤同8,但取异株的花粉授于内壁上,检测内壁和异株授粉情况。

不同花朵之间传粉授粉时,选择花冠和花药都未裂开的花朵进行试验,每次取花药时都将镊子用75%的酒精消毒,避免交叉传粉,以防摘取部位感染,影响结果准确率。网袋选用网孔为1 mm×1 mm的尼龙筛网,防止昆虫传粉;纸袋选用透气、透光和防水的硫酸纸袋,大小为8 cm×5 cm,套袋时用回形针将纸袋开口处夹住,待花朵完全枯萎时取掉其纸袋,以防影响果实发育。

1.6 传粉媒介观察

在田间划取3个3 m×3 m样方,盛花期时每天每隔2 h观察一次,持续观察8 d,观察传粉的媒介以及传粉昆虫出现的时间。

2 数据分析

2.1 开花动态观察

观测结果(表2)表明,该试验地于7月中旬(7月20日)开始现蕾,7月下旬(7月30日)进入初花期,开花数小于30%,8月上旬(8月10日)进入盛花初期,开花数在30%～50%,盛花期在8月中旬至8月下旬,盛花期时间较长,大约20 d。9月中旬进入开花末期,开花数量少于10%。

表2 党参开花时期Table 2 Flowering period of Codonopsis pilosula

党参藤蔓较长,相互缠绕,茎色为绿色有些具有紫色斑纹,内含乳白色乳汁,分枝较多。花萼多为5裂少见4裂,花冠钟状,雄蕊5,柱头多为3裂少见4裂、5裂。子房常为下位或半下位。花冠多为淡黄色,有些具有浅紫色花纹。通过对田间党参花朵的观察,党参从现蕾至开花结束主要经历以下几个过程,蕾期—花萼开裂—花冠开裂—雌蕊偏离柱头—柱头开裂向下卷曲—花冠枯萎。为使开花动态的观测更加直观,用数字代表每个进程(表3)。

表3 开花动态观测Table 3 Flowering dynamic abservation

图1 党参花柱头内外壁Fig.1 Inner and outer wall of Codonopsis pilosula stigma

图2 不同等级党参花朵Fig.2 Different grades of Codonopsis pilosula flowers

表4 不同等级党参花朵花粉活力的比较Table 4 Comparison of pollen vitality of different grades of Codonopsis pilosula

图3 不同等级党参花朵柱头在联苯胺-过氧化氢反应液中的动态变化Fig.3 Dynamic changes of the aniline-hydrogen peroxide for different grades of Codonopsis pilosula flowers

图4 党参花朵传粉媒介Fig.4 The flower pollinator of Codonopsis pilosula

通过观察发现,党参为两性花,既有雌蕊又有雄蕊,大多党参花冠裂开初期,雄蕊紧贴柱头,但花药也伴随裂开,花粉被释放至柱头上。开花动态观察结果表明,花萼从有小裂缝至完全裂开需经历6～8 h,花冠裂开后4～8 h雄蕊开始偏离柱头,随后贴合花冠内部并干枯,柱头多在花冠裂开后24 h左右开始裂开,其单花寿命2～3 d。

2.2 花粉活力

通过观察党参花的开花动态,根据花粉呈现,柱头裂开及花萼、花冠展开状态,可将不同形态的党参花分为以下8个等级:1级为蕾期,花萼将花冠完全包裹,未见花冠但柱头尚未裂开;2级为花苞鼓起,花萼裂开,但未翘起;3级为花萼全部翘起,但花冠还未裂开;4级为花冠裂开,雄蕊还未偏离柱头;5级为雄蕊偏离柱头,但柱头尚未裂开;6级为柱头裂开;7级为花冠边缘枯萎;8级为花冠完全枯萎。因党参花具有花粉二次呈现的特性,4级后的花朵在柱头上取其花粉进行测定。

将8个不同等级花朵分别用TTC测定其花粉活力,结果显示,在蕾期花萼未开裂时花粉就已具有活力,为26.28%;花粉粒在花药中不断成熟,花粉粒总数及活率均呈直线上升趋势,且2级较1级弱活力花粉率极显著增加(p<0.01)。直到花冠裂开时,花粉粒总数、强活力花粉粒数及花粉活力达最大(p<0.05),因4级花朵的花药已裂开,且花药裂开时紧贴柱头,因此大部分的花粉散落在柱头上。在雄蕊偏离柱头后(5级～8级)花粉粒总数及强花粉粒数呈逐渐下降趋势,尤其当花冠完全枯萎时,花药已完全干枯,且柱头外壁的花粉几乎洒落,视野内可以看到的花粉粒数极显著降低(p<0.01),花粉活力率和弱活力花粉率极显著下降(p<0.01),强活力花粉率在花药裂开后极显著降低(p<0.01)。以上结果显示,在党参花朵整个发育过程中,花粉粒总数、花粉活力及强花粉活力呈先升后降的趋势,均在4级达到最大值,是有性杂交最佳花粉采集花朵。

2.3 柱头可受性

观察发现,在花蕾期,花萼未翘起时,柱头周围无气泡产生,所以不具备可受性;等级3花朵的柱头周围部分有少量气泡产生,部分无气泡,因此当花萼翘起时,部分花柱头外壁开始具有可受性;花萼展开,柱头未开裂时,柱头外壁周围气泡明显增多,生泡速度加快,说明可受性明显增强;当柱头开裂时,柱头内外壁都有大量气泡产生,而且内壁比外壁产生气泡更多,生泡速度更快,柱头可受性更强;党参花朵要枯萎时柱头外壁无气泡产生,内壁气泡较6级有所减少。测定结果表明,党参花朵自整个发育过程中,花萼与花冠未分离时柱头不具可受性,当花萼、花冠展开,柱头尚未裂开时,柱头外壁具有可受性但可受性不强,当柱头裂开后,柱头内壁可受性最强。

综上所述,党参花朵在整个发育过程中,花朵的花粉均具有活力,在花冠开裂前,部分花朵柱头已具有可受性,表示党参存在自交结实。但花粉活力最强是花药和柱头尚未分离时,柱头可受性最强是在柱头开裂时,说明同一朵党参花雌雄蕊的强活力出现时间错位,以减少自花授粉的几率。

2.4 授粉特性研究

由表5可知,在各授粉处理中不去雄套袋的结实率为9.00%,去雄不套袋的结实率为40.00%,去雄套网袋的结实率为10.00%,证明党参主要是异花授粉,也可自花授粉,但自交结实率远低于异花授粉的结实率,因此,党参以异花授粉为主,但存在自交亲和性;在异花授粉的过程中,昆虫是主要的传粉媒介,但风也是授粉的媒介之一。去雄套纸袋的结实率为0,则表明党参不存在融合生殖的现象。同株异花外壁授粉结实率为10.00%,异株异花外壁授粉结实率为15.00%,同株异花内壁授粉为20.00%,异株异花内壁授粉为25.00%,证明党参柱头内外壁皆可授粉,但外壁授粉后结实的成功率低于内壁授粉,且异株授粉的结实率高于同株授粉。综上所述,党参存在自交结实,但以异花传粉为主,在传粉的过程中,传粉媒介有风媒、虫媒,但昆虫是主要的传粉媒介。

表5 党参田间结实统计结果Table 5 Statistical results of the field fruit of Codonopsis pilosula

2.5 传粉媒介观察

通过田间观察发现,蜜蜂和苍蝇为主的昆虫经常出没在田间,且蜂蜜出没时可在田间听到清晰的嗡嗡声,因此,通过声音和数量可判定每天11:00—15:00时访花的蜜蜂较多,蜜蜂访花的原因可能与党参花冠中花盘上的蜜腺点有关;大部分蜂蜜在花冠中都呈头在柱头下的姿势,或是卷曲在柱头下,采蜜的过程中在蜜蜂胸腹、足等位置粘有花粉。因此结合授粉套袋实验更加说明,党参传粉媒介主要以昆虫传粉为主,但也不能排除风媒。

3 讨 论

3.1 党参花粉二次呈现特性

植物的花朵在传粉过程中为了提高花粉散在柱头上增强授粉的几率,通常通过调整花粉的呈现形式来降低或减少花粉在传递过程中的损耗[12]。花粉二次呈现是指花粉从花药中散出后被释放到另一个花器官表面,再从此部位呈献给传粉者的特征[13]。菊科、豆科、天南星科、半边莲科、远志科等都具有此类特征,但不同科属植物次级花粉的呈现形式不同,且Leins P,Erbar C[14]对其次级花粉呈现的类型进行了详细的研究;张建等[15]研究了东北蒲公英次级花粉的呈现方式,是柱头在延长的过程中随着柱头下表面具刺状的突起将花粉从聚合花药中带出。除植物自身特性外,动物也是参与传粉推动植物花部特征进化的重要驱动力[16]。本试验结果显示,党参在花冠展开的同时也伴随着花药的裂开,但由于花药紧贴柱头,因此花药中释放出来的花粉大多集中于柱头上,当雄蕊开始偏离柱头时,雄蕊开始枯萎。花粉释放在柱头上时的花粉活力最强,此时柱头已具有可受性,但是较弱,当柱头裂开时柱头内壁可受性最强,但此时的花粉活力相对减弱,结合授粉试验可知,不去雄套纸袋时党参的结实率为9.00%,结实率在各项处理中最低,这与党参柱头强可受性及花粉强活力最佳时间不相交有关。因花粉二次呈现在柱头上,增加了花粉传播的途径,异花授粉的结实率为40.00%,风媒传粉的结实率为10.00%,由此可知昆虫是主要的传粉媒介。结合大田观察可知,蜜蜂是主要的传粉昆虫,因党参花盘的五个角都具有分泌花蜜的蜜腺点,当蜜蜂在采集花蜜的同时会通过柱头带走部分花粉。

3.2 党参繁育系统为异交为主,存在自交亲和性,无融合生殖

在众多的繁育系统类型中,植物的有性繁殖是通过授粉受精形成种子,进而繁育后代的繁殖方式[17]。因此植物的繁育方式在植物的性状遗传和变异方面具有重要的意义[18]。绝对自交、绝对异交的植物较少,大多植物是两种混交的模式[19]。王丽[20]研究认为,新疆党参不能进行自发的自花传粉,且自交不亲和。王艳芳等[21]认为,党参不存在风媒传粉,且柱头外侧不具有可受性。本研究结果显示,党参在花冠未展开前,柱头已具有可受性及花粉具有活力,并且部分花药已散落花粉粒于柱头,再结合不去雄套纸袋结实率为9.00%均能说明党参存在自交亲和,但是根据柱头可受性的观察以及内外壁授粉后的结实情况,认为党参柱头外壁具备可授性,并在党参花冠及柱头裂开时,柱头内外壁可受性均达到最大,此时通过传粉媒介异花授粉结实几率更大,与去雄不套袋结实率40%结果相一致,由此说明党参繁育系统属于两种混交模式,授粉结实存在自交亲和性,但以异交为主。本研究还揭示,党参去雄套纸袋不结实和去雄套网袋结实率仅10%,既反映出党参风媒传粉的可能,也反映出党参无法孤雌生殖。