吴震洋 宋兴超 罗杰 廖恩俊 田旭 艾德钱 王云燕 李丽

(1.铜仁学院农林工程与规划学院，贵州 铜仁 554300；2.甘肃农业大学食品科学学院，甘肃 兰州 741000；3.铜仁职业技术学院，贵州 铜仁 554300)

长顺绿壳蛋鸡作为我国珍稀地方品种之一，具有觅食性强、耐粗饲，蛋壳厚且质密，蛋壳颜色呈现不同程度绿色等特点。长顺绿壳蛋鸡选育较晚，目前还未开展系统性的选育工作，开产日龄为165～195日龄，开产日龄相对较晚，且年产蛋量120～150个，年产蛋量很低。有关蛋壳颜色的研究开展于20世纪初，蛋壳颜色主要由3种色素所决定[1，2]。其中，绿壳蛋鸡的绿壳性状是胆绿素及其锌螯合物在鸡蛋形成过程中沉积在蛋壳中所致[3]。虽然蛋壳形成的部位在鸡输卵管的子宫部，但胆绿素的合成和分泌部位仍存在争议。

Bruckner等最早发现绿壳基因和豆冠基因连锁[4]，而Zartman则将豆冠基因定位到鸡的1号染色体，说明绿壳基因位于鸡的1号染色体[5]。随后发现了和绿壳基因连锁的许多基因、SNP位点或分子标记，进一步将绿壳基因在1号染色体的位置精细化。Wang[6]等通过对有机阴离子转运体1C1基因(SLCO1C1)表达水平的分析，发现SLCO1C1基因影响绿壳蛋的形成。而Wang等[6]和Wragg等[7]最终阐明绿壳蛋形成的分子机制。

本试验利用绿壳蛋鸡蛋壳颜色性状的分子标记对长顺绿壳蛋鸡进行了初步的选育，分别以长顺绿壳蛋鸡和罗曼粉蛋鸡为父、母本进行杂交，观察杂交F1代的体型、外貌特征及生长性能，为探讨杂交F1代的可利用性及杂交模式提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验父本为长顺绿壳蛋鸡公鸡，母本为罗曼粉白羽蛋鸡，饲养场地为铜仁职业技术学院养殖场，饲养方式为笼养，并在雏鸡脱温后进行淘汰选留。选取30只180日龄携带绿壳基因且采精反应强的长顺绿壳蛋鸡公鸡作为父本，210只173日龄处于产蛋期的罗曼粉白羽蛋鸡作为母本进行杂交试验。采用人工授精的方式进行配种，比例为1只公鸡配种7只母鸡，每只母鸡随机收集7～8枚种蛋共计1538枚种蛋进行孵化。日粮组成及营养水平见表1。

1.2 外貌观测及绿壳性状雏鸡筛选

出雏当天，观察F1代雏鸡初生羽色，统计各类型羽色比例。F1代30日龄时，翅静脉采血，提取DNA后利用分子标记对绿壳性状基因检测，对绿壳基因型进一步判别，筛选产绿壳鸡蛋的雏鸡，最终筛选出370只雏鸡进行进一步饲养。绿壳基因纯合型标注为LC/LC，绿壳基因杂合性标注为LC/N，非绿壳基因型标注为N/N。分子标记引物序列见表2。

表1 试验鸡日粮组成及各阶段营养水平

表2 引物序列信息

1.3 生长性能指标测定

测定亲代和F1代的试验群体生长性能，测定方法依据《NY/T 823-2004家禽生产性能名词术语和度量统计方法》。F1代分别在30日龄和60日龄时，各随机选择40只公鸡和40只母鸡进行生长性能指标测定。

1.4 统计与分析

用Excel软件对数据进行整理，使用SPSS 21.0进行t检验分析差异显著性，定义P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 杂交F1代与亲代外观比较

父本长顺绿壳蛋鸡公鸡背羽、腹羽红黑相间，颈羽、鞍羽赤红，主翼羽、尾羽墨绿而有光泽；母本罗曼粉羽色均为纯白色。杂交F1代共孵化出1276羽雏鸡，677羽公雏，599羽母雏进行育雏，40日龄时观察羽色。F1代总体分为白羽、红麻羽和黑羽3种羽色，分别占64.03%、24.37%、11.60%。F1代麻羽分为2种羽色，一种是麻色深度与纯度不及长顺绿壳蛋鸡公鸡，另一种以红褐色为主而无麻色羽毛或麻色较浅，与长顺绿壳蛋鸡差异较大。而白羽与罗曼粉蛋鸡羽色一样，黑羽为新分离出的毛色。整体而言，F1代羽色出现明显分化，白羽个体为主，还出现了麻色和红褐色的个体，少部分为黑色，与长顺绿壳蛋鸡总体相似的麻羽个体较少。

图1 杂交一代羽色分布

2.2 杂交F1代的绿壳性状筛选

经过对父代50羽长顺绿壳蛋鸡、40日龄F1代公鸡677羽、母鸡599羽共计1276羽进行基因型判断，F1代公鸡的绿壳基因型为82.3%，母鸡的绿壳基因型为82.8%，选留产绿壳蛋母鸡270羽留种，淘汰产粉壳蛋的个体。公鸡的选育首先按照红麻羽、黑羽和白羽的顺序选留，共选取50羽进行留种。图2为绿壳基因检测电泳图片，表3为鸡群体中的基因型频率。

注：Marker条带为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、1500bp、2000bp。

表3 长顺绿壳蛋鸡及F1代群体中的基因型频率

2.3 杂交F1代的生长性能

杂交F1代1周龄、3周龄、5周龄、6周龄、7周龄、8周龄、9周龄、10周龄母鸡平均体重分别为71.34g、167.21g、326.58g、357.01g、364.56g、410.50g、620.06g、645.93g，见图2。杂交F1代日龄母鸡体重呈上升趋势，1～5周龄体重上升较快，6～8周龄趋于平缓，9周龄时体重有较大上升。商品代罗曼粉蛋鸡体重则呈现稳步增长，和商品代罗曼粉蛋鸡1～10周龄体重数据相比，F1代雏鸡体重均比商品代罗曼粉蛋鸡体重轻。

与亲代相比，F1代母鸡1周龄、3周龄、5周龄体重和同周龄罗曼粉母鸡(P>0.05)差异不显著，但6周龄、7周龄、8周龄、9周龄、10周龄体重均极显著低于同周龄罗曼粉母鸡(P<0.01)。

图3 1～10周龄雏鸡体重增长趋势

3 讨论

本试验选用长顺绿壳蛋鸡为父本，罗曼粉蛋鸡为母本进行杂交，目的将绿壳基因导入到杂交F1代中，通过绿壳基因分子标记对F1代进行筛选，使得F1代的绿壳率达到90%以上并测量其生长性能。后续再利用筛选出的F1代作为父本，不断和罗曼粉蛋鸡进行级进杂交，以期获得高产的绿壳蛋鸡，最后通过横交固定进行纯系的培育。而毛色的改良则在纯系培育的基础上，进行进一步的杂交改良，以期获得较好的商品代鸡种，提高市场的竞争力。

长顺绿壳蛋鸡与罗曼粉白羽蛋鸡的杂交F1代以白羽为主，占比64.03%，其次为红麻羽，占比24.37%，其余为黑羽。鸡的某些羽色除了单基因或少数基因控制外，还存在基因互作效应，因此不同品种的鸡进行杂交，会出现不同程度的羽色分离或出现新的羽色。鸡的羽色由多种色素共同作用而形成，麻羽色基因由E(Extension)座位的2个以上等位基因控制[8]，但显性白羽基因在其它羽色中占主导地位，由于母本为白色罗曼粉蛋鸡，尽管父本为长顺绿壳蛋鸡，但F1代中仍出现了较多白羽雏鸡。因此，如利用隐性白羽蛋鸡，则会出现较好的毛色体现，但获得隐性白羽鸡作为育种素材则较为困难。而出现的黑羽则有可能是父本长顺绿壳蛋鸡混有黑羽鸡的血统，导致F1代中出现了黑羽性状的分离。曾道曙等[9]利用长顺绿壳蛋鸡与隐性矮小白鸡杂交，杂交一代黄麻羽母鸡占比70.69%，深麻羽为22.20%，麻羽比例高达92.89%，这是由于母本为隐性白羽，从而获得的F1代可用于替代长顺绿壳蛋鸡。本试验F1代麻羽出现了与长顺绿壳蛋鸡亲本类似的麻羽和红褐色羽2种颜色，此种颜色的个体可留作开发为替代长顺绿壳蛋鸡的父母代，新出现的黑羽可在开发中淘汰或作为生产配套系使用，而白羽可和罗曼粉蛋鸡作进一步的级进杂交，用以产生高产绿壳蛋鸡和纯系使用。

为了利用好长顺绿壳蛋鸡品种资源、快速筛选出携带绿壳基因的个体且提高杂交群体的产蛋率，本试验利用分子标记快速筛选长顺绿壳蛋鸡父代的绿壳基因，并根据筛选数据进行组建家系，获得了若干携带绿壳基因的杂交群体，加快了选育进度。Wang等[6]发现逆转录病毒EAV-HP元件的反向插入到SLCO1B3基因5′-非编码区后，可使得SLCO1 B3在输卵管壳腺部特异性高表达，导致母鸡产绿壳蛋，并将该绿壳基因定位到1号染色体中[6]。国外学者Wragg等[7]也报道了类似研究，但所用分子标记比Wang等更准确。本试验检测了长顺绿壳蛋鸡公鸡的绿壳基因型，筛选出纯合和杂合的父本后在和罗曼粉母鸡进行杂交，结果表明，纯合父本长顺绿壳蛋鸡和罗曼粉蛋鸡的F1代为杂合产绿壳蛋蛋的基因型(LC/N)，公、母雏绿壳基因型分别为82.3%和82.8%。本试验通过对杂交群体的生长性能、羽色等分析，有望通过级进杂交培育出替代长顺绿壳蛋鸡且产蛋量高的杂交群体。

家禽早期体重是肉用禽类育种的目标，也是衡量肉鸡生长、生产能力的重要性状[10]。本试验中，1～5周龄F1代杂交母鸡与罗曼粉亲代相比，体重差异不显著，第6周龄开始，F1代杂交群体母鸡的体重均极显著低于同周龄罗曼粉母鸡(P<0.01)，并未表现出明显的杂种优势。这有可能和父本长顺绿壳蛋鸡有关。谢卓君等研究了清远麻鸡和隐性白羽蛋鸡的杂交一代，结果表明，杂交F1代母鸡体重和体型均比其母本矮小隐性白羽蛋鸡更大，F1代公鸡体重小于其父本清远麻公鸡[11]。刘嘉等[12]比较了绿壳蛋鸡和芦花鸡的杂交后代体尺性状，结果表明，杂交一代胸深和胫围均小于父母代。贺兴龙[13]则研究了苏禽绿壳蛋鸡和白来航蛋鸡正、反交杂交一代的生长性状，结果表明，不论是白来航公鸡和苏禽绿壳蛋鸡母鸡杂交F1代，还是苏禽绿壳蛋鸡公鸡和白来航母鸡的反交结果，40周龄杂交1代公、母鸡体重均比其对应的父母代亲本体重小。姜慧绘[14]探讨了长顺绿壳蛋鸡公鸡和矮小隐性白鸡母鸡杂交一代的体重，结果表明，杂交一代的体重接近长顺绿壳蛋鸡。本试验用长顺绿壳蛋鸡和罗曼粉蛋鸡进行杂交，F1代母鸡比母本体重较轻，说明长顺绿壳蛋鸡作为我国优良的地方品种，虽然经过了一定的人工选择，但仍然具有生长缓慢的特点，F1代雏鸡受到了父本遗传效应的影响较大，也可能和不同的杂交组合及长顺绿壳蛋鸡的纯度有关。

4 结论

杂交F1代初生以与罗曼粉母本为主的白羽，占比64.03%，白羽可和罗曼粉蛋鸡作进一步的级进杂交，用以产生高产绿壳蛋鸡。成年杂交F1代公鸡和母鸡均出现羽色分化或变异，出现了与长顺绿壳蛋鸡亲本类似的麻羽和红褐色羽2种颜色，占比24.37%，此种颜色的个体也可留作开发为替代长顺绿壳蛋鸡的父母代或参与到后续的级进杂交中，新出现的黑羽占比11.60%，可在开发中淘汰或作为生产商品代时为配套系使用；杂交F1代母鸡体重和体型均比其母本小，且差异极显著，后续可通过级进杂交再做进一步的生长性能测定，以期达到和罗曼粉蛋鸡相似的体重水平和产蛋性能。因此，通过后续的杂交试验和横交固定选育，有望培育出高产的可替代长顺绿壳蛋鸡的父母代亲本及纯系。