刘霞飞,杨合霖,王念民,吕伟华,徐 伟,曹顶臣,张 颖

(1.中国水产科学研究院 黑龙江水产研究所,黑龙江 哈尔滨 150076;2.大连海洋大学 水产与生命学院,辽宁 大连 116023)

鲟鱼隶属于辐鳍亚纲(Actimopterygii)、软骨硬鳞总目(Chondrostei)、鲟形目(Acipenser iforms),起源于白垩纪时期,被誉为“水中活化石”[1],具有极高的经济价值、营养价值和科研价值。20世纪80年代以来,由于过度捕捞、水质污染和水利工程等原因,世界范围内鲟鱼野生资源量锐减,已于1998年被列为《濒危动植物国际贸易公约》附录Ⅱ保护物种[1]。为满足市场需求,鲟鱼生产已逐渐由捕捞转变为人工养殖,20世纪90年代至今,我国先后攻克鲟鱼人工繁育、苗种驯养、病害防治、饲料生产、鱼子酱及相关产品加工等一系列关键技术,已发展为世界上最大的鲟鱼养殖国和鱼子酱出口国,目前,我国的养殖年产量达9万t,占世界鲟鱼产量的80%以上[2]。杂交鲟鲟龙1号(Husodauricus♀×Acipenserschrenckii♂)作为我国鱼子酱生产的主要品种,兼具生长快和性腺发育早等优势,深受养殖户的欢迎[3]。

某高层住宅楼采用剪力墙结构、筏板基础。地基处理采用C20的CFG桩提高地基承载力，CFG桩桩径500 mm，桩长24 m，桩间距1.6 m，按正三角形梅花形满堂布置，总桩数660根，复合地基承载力特征值不小于450 kPa。场地工程地质条件如表1所示。

我国内陆有大量的中高盐碱水域处于荒芜状态,拓宽这些宜渔水域,是保持渔业可持续发展的重要途径,此外,通过渔农综合治理,也可有效缓解土地次生盐碱化程度,使无法耕作的低洼盐碱地得到利用。且我国内陆盐碱水资源丰富,以西北和东北地区的碳酸盐型的盐碱湖泊、沼泽及浅层地下半咸水居多,具有扩张的趋势。研究证实,“以渔改碱”是开发利用盐碱水资源的有效途径,因此,盐碱渔业相关技术的研究对改善盐碱地区的生态环境,有效地利用盐碱水域具有重要的作用[4]。目前,有关淡水鱼类耐盐碱驯养研究的相关报道较多,如对黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[5]、乌苏里拟鲿(Pseudobagrusussuriensis)[6]、欧鲇(Silurusglanis)[7]、异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)[8-10]、卡拉白鱼(Chalcalburnuschalcoidesaralensis)[11]、叶尔羌高原鳅(Triplophysayarkandensis)[12]、淡水白鲳幼鱼(Colossomabrachypomum)[13]等鱼类的耐盐碱研究表明,淡水鱼类的耐盐碱范围比较宽泛,且耐盐碱机制也各不相同,目前,关于鲟鱼盐碱驯养的相关研究多数集中在盐度对其的影响[14-15],而关于鲟鱼的碱度驯养的相关研究报道则较少。

在进行林木种苗培育的过程中，另外一个非常重要的管护因素就是光照因素。管理人员应该依照林木种苗的生长需要来严格控制种苗接受光照的时间和强度。在遇到特殊情况的时候（如干旱），管理人员应该及时通过各种方式来对光照进行调控，这样才可以更好的保证林木种苗的健康成长。

鱼类皮肤在维持鱼类体内稳态的同时,还参与机体与外界水环境的免疫调节,包括免疫防御、体液调节、运动感知以及繁殖活动等[16-17],且皮肤长期暴露于水环境中,是与外界环境接触面积最大的黏膜层组织[18],尤其是对于鲟鱼这种无鳞鱼类,皮肤是鱼体与外界直接接触的第一道门户[19],当机体受到环境刺激后,体表的黏液细胞则大量分泌,其中含有黏多糖、糖蛋白、免疫球蛋白及各种水解性酶类等多种活性物质[20-21],以此来缓冲盐碱环境下机体受到的伤害。因此,本研究基于转录组高通量测序对鲟龙1号皮肤组织进行转录组测序,比较分析正常条件下和碱胁迫下杂交鲟鲟龙1号的皮肤分子特征,并构建代谢通路互作网络,以期为揭示无鳞鱼类的耐盐碱机制提供基础数据。

今年的年会上，学会推荐报送的论文中，云南电网有限责任公司注册参会28篇，电力科学研究院《大容量STATCOM装置在直流交换站的控制策略及响应分析》获优秀论文奖，5篇参加会议宣讲，18篇参加会议张贴。参加会议宣讲的作者代表均到现场参与了交流分享。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验养殖7 d后进行样品采集,用40 mg/L的 MS-222 在试验相同盐碱浓度下麻醉。于对照组和最高浓度处理组分别随机采取5尾鱼进行解剖,将其皮肤于液氮临时保存,转于-80 ℃冰箱保存,用于转录组测序。

每组随机试养15尾杂交鲟进行耐受试验,试验期间水温为14～16 ℃,溶氧量大于9 mg/L,投喂颗粒饲料每天2次(9:00和15:00),日投饵率为1%。根据水质情况,每2～3日更换相同碱度新水,保持水质清洁。

在进行施工准备工作前，一定要积极配合建设单位进行组织设计的交底工作，对于施工的设计文件一定要进行仔细的审核，也要结合实际的工程需要，进行必要的验证以及补测。对于可能发生塌方的区域，必须要做好一定的必要准备，在施工的过程中，必须做好相对应的预防措施。在必要的情况下，采取相对的应急措施以消除各种不利因素的影响。只有这样，才可以避免塌方的产生。由于隧洞的地质条件相对比较复杂，对于质量的监控以及地址预报的工作必须要做好。

试验鱼为30日龄的杂交鲟鲟龙1号,取自中国水产科学研究院呼兰养殖基地。养殖水体为食用级碳酸氢钠(纯度为99%)溶于曝气2 d的自来水,体积为180 L。本试验设置了1个对照组与3个处理组,对照组为自来水,实际测定碱度为3.13～3.20 mmol/L,试验组为添加99%纯度的食用NaHCO3,试验组实际测定碱度分别为7.47～7.73 mmol/L,11.6～12.6 mmol/L,14.4～16.67 mmol/L,每组设3个平行组,每个平行组养殖15尾,共180尾。

将试验组和对照组分别采集皮肤,肾脏组织,于Bouin′s 液中固定,48 h后更换新的固定液后4 ℃保存。

人急性单核细胞白血病细胞株U937购自中科院上海细胞库。细菌菌株：大肠杆菌DH5α购自TIANGEN生物公司。质粒：pMD-18T载体，购自Takara公司。T4 DNA连接酶、Taq DNA Polymerase、High Fidelity PrimeScript RT-PCR、DNA凝胶回收试剂盒、High Fidelity PrimeScript RT-PCR Kit、5'-Full RACE Kit、3'-Full RACE Kit均购自Takara公司；质粒快速提取试剂盒购自TIANGEN公司。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA提取及转录组测序 利用TRIzol法抽提试剂盒提取总RNA。采用紫外分光光度计检测各RNA样品的纯度、浓度及完整性等。转录组测序由欧易生物医学科技有限公司(上海)完成,利用 Illumina Hi Seq 500(Illumina,America)平台进行高通量测序,其方法可以参考Nan等[22]。使用Cytoscape软件构建代谢通路互作网络。

1.2.2 测序数据组装及基因功能注释 将原始数据(Raw reads)进行分析和过滤,把接头序列、未知序列以及低质量序列除去,得到干净数据(Cleanreads)。转录本的拼装通过Trinity(v2.5.1 版本)软件实现,每个基因的最长的转录本被读为单基因(Unigene)[23],将其作为后续深入分析的参考序列保留。

为了解上述基因的详细信息,将其与Nt、Nr、KOG、Swiss-Prot、KEGG[24]、Pfam[25-26]、GO[27]等数据库进行比对注释。

1.2.3 基因表达水平和差异表达分析 把得到的Clean reads与转录本用Bowtie 2软件比对,得到相应基因的read count数目[28]。将其进行处理后分析得到该基因的表达水平。用DEG-seq进行差异分析。

1.2.4 差异基因的富集分析 将DEG基因采用GO富集分析,然后进行功能描述。找出DEG基因被注释的基因相对应的显著富集的pathway。根据KEGG 数据库资源,进行通路富集分析,并使用KOBAS软件对其差异基因进行富集统计[29]。

1.2.5 qPCR 验证 为了验证转录组数据的准确性,筛选了7个具有差异表达的基因(表1) 进行实时荧光定量PCR(qPCR)。使用与转录组测序同批次的RNA进行反转录,获得相应的cDNA,稀释后每个样品进行3个技术重复,以β-actin为参考基因,在Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-time PCR System定量仪中进行 qPCR。反应体系包括5 μL 2×TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus),上、下游引物各0.4 μL(10 μmol/L),1 μL cDNA,3 μL ddH2O,0.2 μL 50×ROX Reference Dye Ⅱ,总体系为 10 μL。反应程序采用三步法:预变性95 ℃ 180 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s(收集荧光),40 个循环;熔解曲线分析PCR 产物的特异性。最后,使用 SPSS 17.0 软件及采用2-ΔΔCt方法分析结果。

表1 引物及序列Tab.1 Primers and sequences

1.3 组织切片及拍照观察

将组织于Bouin′s 固定液中取出,取体积约为2.0 cm×1.5 cm×0.3 cm,进行梯度脱水,透明,包埋,切片,脱蜡,染色,封片。具体实验操作步骤参照高珊等[30]的方法。最后用光学显微镜(Leica)观察并拍照。

从表2的数据统计来看：游览次数分布比较平均，占比最多的是2次，占35.03%。游览时间最多的是周末和自由时间，均占比39.25%。游览目的首要的是陪伴小朋友及家人，占比53.7%；其次是休闲放松、舒缓压力，占比37.85%。信息获取渠道主要通过熟人介绍、网络信息、旅游宣传册和电视广告，四项合计占比87.45%。

2 结果与分析

2.1 转录组数据及组装

本研究提取了鲟龙1号皮肤的总RNA,并构建了相应的cDNA文库[31]。通过Illumina NextSeq 500平台对6个样品进行测序,共获得的41.5 G的Clean data,各样本的有效数据量分布在 6.59～7.27 G,Q30碱基分布在 95.76%～96.29%,平均 GC含量均在45%以上。该结果显示测序质量可靠,构建文库可用于后续分析(表2)。

表2 测序数据统计Tab.2 Summary of RAN-seq dates

通过Trinity软件拼接,并挑选出最长的序列作为Unigene。最终获得Unigene数量80 422条,总长度为88 658 788 bp(表3)。

表3 转录本拼接结果统计Tab.3 Statistics of transcript splicing results

利用Bowtie 2 将 Clean reads 比对到 Unigene,总比对率为88.64%～91.09%,多位点比对率为24.48%～28.63%,单一位点比对率为62.18%～66.61%(表4)。

表4 Clean reads与 Unigene 比对结果统计Tab.4 Comparison results statistics of Clean reads and Unigene

2.2 转录组功能注释

为获得全面的 Unigene 功能信息,将Unigene与 NR、NT、KEGG、Swiss-Prot、Pfam、KOG和GO公共数据库进行比对,结果显示,NR注释的Unigene比例最高(38.64%),共注释到31 078个Unigene,KEGG注释的Unigene比例最低(22.71%),共注释到18 262个Unigene(表5)。

表5 NR、NT、KEGG、Swiss-Prot、Pfam、KOG和GO数据库的注释结果Tab.5 Annotation results of NR,NT,KEGG,Swiss-Prot,Pfam,KOG and GO

2.3 杂交鲟差异表达基因聚类分析

碱胁迫组与对照组在皮肤的差异表达基因数量为1 849个,显著上调基因1 302个,显著下调基因为547个(图1)。对差异表达基因进行聚类热图分析(图2),结果显示,鲟龙1号的淡水组和碱胁迫组的差异表达基因分别聚类,同组样本不同重复表达相似。

红色代表上调基因;绿色代表下调基因(P<0.05)。The red balls represent up regulated gene;the green balls represent down regulated gene.图1 对照组与胁迫组差异基因表达火山图Fig.1 Volcano plot of differential gene expression between control and stress groups

图2 对照组和胁迫组差异基因表达热图Fig.2 Heatmap of differential gene expression between control and stress groups

2.4 杂交鲟差异表达基因GO富集分析

差异表达基因富集到生物过程的主要有细胞膜钙离子浓度的调节、肌肉收缩和蛋白质侧链脱谷氨酰化;富集到细胞组分主要有肌钙蛋白复合物、肌浆网膜连接和肌球蛋白丝;分子功能主要有肌钙蛋白T结合、肌钙蛋白C结合、肌钙蛋白Ⅰ结合和核糖体结构成分等,这些富集条目的相关基因表达均显著上调(表5、图3)。

1.细胞膜钙离子浓度调节;2.肌肉收缩;3.蛋白质侧链脱谷氨酰化;4.骨骼肌收缩;5.C-末端蛋白质脱谷氨酰化;6.赖诺丁敏感钙释放通道的正调控;7.调节肌肉收缩;8.钙离子释放至胞液;9.心肌收缩;10.ATP响应;11.肌钙蛋白复合物;12.肌浆网膜连接;13.肌球蛋白;14.肌原纤维;15.呼吸链;16.横纹肌;17.胶原蛋白三聚体;18.Z板(肌间盘);19.肌纤维;20.钙通道复合体;21.肌钙蛋白T结合;22.肌钙蛋白C结合;23.肌钙蛋白Ⅰ结合; 24.5-氨基乙酰丙酸合酶活性;25.肌肉的结构组成;26.钙离子结合;27.金属羧肽酶活性 ;28.神经递质:钠同向转运蛋白活性;29.系统活性; 30.核糖体的结构成分。1.Regulation of cytosolic calcium ion concentration;2.Muscle contraction;3.Protein side chain deglutamylation;4.Skeletal muscle contraction;5.C-terminal protein deglutamylation;6.Positive regulation of ryanodine-sensitive calcium-release channel;7.Regulation of muscle contraction;8.Regulation of release of sequestered calcium ion into cytosol by;9.Cardiac muscle contraction;10.Response to ATP;11.Troponin complex;12.Junctional sarcoplasmic reticulum membrane;13.Myosin filament;14.Myofibril;15.Respiratory chain;16.Striated muscle thin filament;17.Collagen trimer;18.Z disc;19.Sarcomere;20.Calcium channel complex;21.Troponin T binding;22.Troponin C binding;23.Troponin Ⅰ binding;24.5-aminolevulinate synthase activity;25.Structural constituent of muscle;26.Calcium ion binding;27.Metallocarboxypeptidase activity;28.Neurotransmitter:sodium symporter activity;29.Channel activity;30.Structural constituent of ribosome.图3 皮肤差异基因代谢通路GO显著富集结果Fig.3 Significant enrichment of Go in skin differential gene metabolic pathway

2.5 杂交鲟差异表达基因KEGG通路富集分析

为进一步了解 DEGs 的功能,对所有 DEGs进行 KEGG 富集分析。共注释到18 262个Unigene,注释比例为22.71%。将差异表达基因反映的代谢通路进行KEGG富集分析,结果显示,对照组和碱胁迫组在代谢通路上显著富集主要有糖酵解/糖异生,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢、淀粉和蔗糖代谢等通路,且这些主要富集通路的相关基因均表达上调(图4)。

1.扩张型心肌症 ko05414;2.肥厚型心肌症 ko05410;3.甲状腺癌 ko05216;4.金黄色葡萄球菌感染 ko05150;5.朊病毒疾病 ko05020;6.蛋白质的消化和吸收 ko04974;7.血小板激活 ko04611;8.补体和凝血级联 ko04610;9.间隙连接 ko04540;10.紧密连接 ko04530;11.ECM受体相互作用 ko04512;12.局部粘连 ko04510;13.肾上腺素能在心肌细胞中的信号传递 ko04261;14.心肌收缩 ko04260;15.钙信号通路 ko04020;16.核糖体 ko03010;17.卟啉和叶绿素的新陈代谢 ko00860;18.淀粉和蔗糖代谢 ko00500;19.甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢 ko00260;20.糖酵解/糖异生 ko00010。颜色梯度由红到绿对应富集显著性由高到低;圆球大小代表显著富集基因的数量。1.Dilated cardiomyopathy;2.Hypertrophic cardiomyopathy(HCM);3.Thyroid cancer;4.Staphylococcus aureus infection;5.Prion diseases;6.Protein digestion and absorption;7.Platelet activation;8.Complement and coagulation cascades;9. Gap junction;10.Tight junction;11.ECM-receptor interaction;12.Focal adhesion;13.Adrenergic signaling in cardiomyocytes;14.Cardiac muscle contraction;15.Calcium signaling pathway;16.Ribosome;17.Porphyrin and chlorophyll metabolism;18.Starch and sucrose metabolism;19.Glycine, serine and threonine metabolism;20.Glycolysis/Gluconeogenesis.The color gradient is from red to green and the corresponding enrichment is from high to low;the size of the sphere represents the number of significantly enriched genes.图4 TOP20皮肤差异基因代谢通路KEGG显著富集结果Fig.4 The significantly enriched pathways and corresponding DEGs number of each pathway

2.6 杂交鲟KEGG代谢通路互作网络分析

qPCR 检测转录组分析结果中 7 个表达差异显著的基因,并将其与转录组分析结果相比较,结果表明,这些基因的表达趋势与转录组分析结果一致,说明 RNA-Seq 结果的可靠性(图5)。

2.7 qPCR 验证和组织表达检测

对KEGG中显著富集到皮肤组织的27个代谢通路(P<0.05)构建代谢通路互作网络,其中黏着斑(Focal adhesion)、蛋白质消化吸收(Protein digestion and absorption)和血小板活化(Platelet activation)等途径为主效途径,这些途径的相关基因在碱胁迫组的皮肤组织中均表达上调,显著富集的通路中有补体和凝血级联(Complement and coagulation cascades),缺氧诱导因子-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路等病理相关途径表达下调。

纵坐标为差异倍数的 log2值。The vertical coordinate is log2(Fold Change)of the difference multiplier.图5 qPCR检测RNA-Seq结果Fig.5 Validation of RNA-Seq data using qPCR

2.8 NaHCO3胁迫下对杂交鲟肾脏、皮肤的结构变化

NaHCO3碱度胁迫下T1、T2与T3组的肾小球和肾小管随着碱度升高,均发生了比较明显的皱缩,T2与T3组肾小球皱缩,体积变小,囊腔变大,其中T3组肾小球上皮细胞发生脱落、弥散;此外,各级肾小管萎缩,间质空隙变大,T3组中远曲小管萎缩尤为明显,上皮细胞体积减小,管壁变薄。

如图7所示,C组和T1组在正常情况下由表皮层和真皮层构成。表皮层主要由扁平上皮细胞、棒状细胞和黏液细胞,以及基底细胞等组成;真皮层位于表皮层之下,主要由黏液细胞、色素细胞等构成。健康下的杂交鲟皮肤表皮层上皮细胞和棒状细胞排列紧密且规则,棒状细胞因嗜酸,所以伊红染色十分显著,且细胞核较小;黏液细胞无肿胀现象,并且黏液细胞数量较少;真皮层由疏松层和致密层构成,前者较厚,后者较薄。疏松层主要为疏松结缔组织,呈网状,网眼细长,含有黑色素细胞,数量极少;致密层是纤维排列紧密的致密结缔组织,有明显的横纹肌。

A—D.C组、T1组、T2组、T3组;Gl.肾小球;CS.颈段;DCT.远曲小管;PCT.近曲小管。A—D.Group C,T1,T2 and T3 respectively;Gl.Glomerulus;CS.Cervical segment;DCT.Distal convoluted tubule;PCT.Proximal convoluted tubule.图6 不同碱度对肾脏的影响Fig.6 Effects of different alkalinity on kidney

如图6所示,C组和T1组在正常情况下杂交鲟肾脏由肾小球、肾小管、连接小管和集合小管组成。肾小球形似一圆囊,其中包括一小球,乃血管缠绕形成,其上皮细胞延伸包围该小球。肾小管与肾小球紧密相连,起首处近曲小管很细,内壁刷状缘丰富,上皮细胞呈柱状,核较大,呈椭圆形,延伸后形成远曲小管,远曲小管微绒毛不发达,核较大,呈椭圆形,且居中位,肾小管末端很细,上皮细胞偏小,形似圆形或方形。连接小管主要连接肾小管和集合小管,起首部较细,延伸后较粗,其上皮细胞系长方形或正方形,细胞内缘无刷状质,嗜伊红,以此明显区分肾小管。集合小管与肾小管及连接小管明显不同,上皮细胞系长柱形,管径要明显大于肾小管。

医护英语智慧课堂教学模式是顺应时代要求的专门用途英语教学的新型课堂教学模式，有利于学生的个性化学习，培养学生创造性学习的能力学生，促进学生创新思维的发展，提升学生解决问题的能力，使学生发展成为真正的“智慧者”[3]。

NaHCO3碱度胁迫下T1、T2与T3组的皮肤的表皮中间层排列随碱度的升高逐渐稀疏,并有脱落的现象发生,尤其是黏液细胞随碱度的升高数量明显增加,且逐渐有肿胀现象发生;同时,棒状细胞的细胞核也有明显的固缩现象,此外,T2与T1组的扁平上皮细胞脱落尤为明显,棒状细胞排列尤为紧密;T3组的表皮层与真皮层有明显的分离并即将脱落的现象,细胞基底层与其他碱度组相比较薄。

3 结论与讨论

3.1 转录组测序质量分析

广义上来说,转录组是指在某一生理条件下,细胞内所有转录产物的集合[32]。近年来,转录组技术主要应用在水生生物的环境胁迫方面,其中,包括温度、低氧、运输以及盐碱胁迫等。通过转录组技术的应用,宋慧[33]发现不同盐度梯度条件下大银鱼(Protosalanxhyalocranius)胚胎的分子适应机制;刘韬等[34]通过转录组技术探索青田田鱼(Tripod fish)在急性低氧胁迫复氧恢复条件下幼脑组织的生理调节机制;寿晨艳[35]对褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)温度盐度下进行了转录组研究,探索了其在温度和盐度胁迫条件下关键基因的调节机制。目前,转录组技术在对水生生物的盐碱胁迫方面的研究还不够成熟,还需进一步进行研究。

本研究中,对杂交鲟鲟龙1号进行从头装配(Denovoassembly)获得80 422条Unigene,总长度为88 658 788 bp,与GenBank中的序列进行比对,结果显示,拼接质量较好,表明了该杂交鲟的转录组测序数据可靠。与NCBI数据库比对结果显示,鲟龙1号的转录组数据比对到Nr数据库仅38.64%,说明仍有约60%的基因未能比对到Nr数据库中。此外,在国际公共数据库GO、KOG和KEGG中的功能注释显示,只有25%左右的Unigene序列被注释到,表明了鲟科鱼类的基因序列在国际公共数据库中收录较少。本研究的Unigene序列结果进一步补充了数据库中鲟科鱼类的基因资源,并且通过基因功能注释,初步揭示了鲟科鱼类部分基因的功能、生物过程和代谢途径,有效为鲟科鱼类的功能基因挖掘提供数据支持。

3.2 差异基因的表达和富集分析

研究证实,高碱环境对鱼体主要产生渗透胁迫和离子胁迫2种胁迫作用,其中渗透胁迫主要是因为环境中离子浓度升高,水分难以进入细胞造成的,而离子胁迫则多指离子过量积累造成的毒害作用[36]。本研究的GO注释和KEGG注释结果表明,杂交鲟皮肤组织中胞浆内钙离子浓度、肌肉收缩、氨基酸代谢、糖代谢和蛋白代谢等相关差异基因均上调表达。在非等渗环境中,鱼体对外界环境作出反应,而这一过程需要能量的消耗[37],消耗的部分主要是从外界的食物供给中获得,所以用于渗透调节的能量越多,用于生长的能量就越少,生长就相对缓慢[38]。随着盐碱度的增加,鱼体抗病能力也会随之下降,根据前期试验结果[39]显示,在当碳酸盐型碱度超过12 mmol/L,杂交鲟幼鱼的摄食量减少、呼吸频率增加,易惊厥游动速度相对加快,生长受到显著抑制,碱胁迫组的生长速度显著慢于对照组,这也与郭雯翡等[40]研究结果相符。

医学生应深入调查并了解医学毕业生的就业现状和就业路径，并进行调查，深入了解创新创业的个人价值和社会价值[6]，树立医学生创新意识和格局意识，转变就业观念，契合国家未来创新体系；各相关高等医学院校应把创新创业融入医学专业教育，成为终身教育；社会媒体的大力宣传，营造全社会支持医学生创新创业的氛围，医学生应从中提高认识，抓住机遇，用所学知识为我国的医疗卫生事业做出贡献[3]。

本研究中,GO富集分析表明高碱养殖条件下,杂交鲟皮肤组织中与胞浆钙离子浓度调节、肌肉收缩、肌钙蛋白复合物、连接肌浆网膜、肌球蛋白丝及肌钙蛋白结合等相关差异基因均上调表达。研究证实,当碱度发生变化时,单向转运Ca2+的ATP酶(Ca2+泵)可为鱼类的渗透调节提供能量[41]。肌质网是细胞内特化的滑面内质网,其膜上最重要的膜蛋白就是Ca2+的ATP酶,以此发挥储存钙离子的功能[42]。肌细胞的细胞膜由于NaHCO3水解后的CO32-与OH-在水中大量聚集,导致细胞膜的选择透过性下降甚至丧失,导致钙离子通道就此打开,大量的钙离子进入细胞质,引起肌肉收缩。也有研究证实,碱性金属元素(尤其是钙离子)能够有效地控制细胞的渗透性和保护细胞膜的完整性,钙离子通过和细胞膜磷脂磷酸盐的结合,增加细胞膜上的结合态脂质,降低膜的流动性后最终使膜通透性降低[43]。Na2CO3和NaHCO3不仅与碱水环境中的Na+浓度有协同作用,导致其产生盐胁迫,还可以借由自身电离和水解反应对环境产生高pH值胁迫[44]。吕富等[10]在研究中发现,当碱度到达10 mmol/L 时,异育银鲫由于水体的pH值升高,进而影响鱼的肠道内的消化酶的最适pH值,导致消化酶活性降低后,抑制了鱼的摄食量,威胁鱼的生长。由此推断,杂交鲟蛋白质消化吸收主效途径下调表达也与此有关,但是具体的影响机制还待进一步探讨。

氨基酸不仅是蛋白质合成的基本原料,还在调节机体代谢和生理过程中发挥多种功效[45]。本研究表明在碱胁迫下,杂交鲟氨基酸代谢通路下调正常表达。研究发现,细胞的增殖分化、神经系统发育以及机体的免疫防御都有丝氨酸的参与,且丝氨酸处于调节生物体的多个生物代谢的重要位置[46],它不仅可以代谢为丙酮酸参与三羧酸循环,也可生成甘氨酸[47],而这个过程是可逆的,甘氨酸在丝氨酸表达低时,则可以重新合成甘氨酸[48-49]。此外,T 细胞的增殖也依靠丝氨酸分解代谢的产物,即一碳单位的嘌呤及嘧啶的合成行使生理功能,促进机体的正常的生命活动[50],从而影响一些免疫因子的表达[51]。Rodriguez 等[52]的研究结果也表明,当从头合成途径受到阻碍后,丝氨酸来源受阻,导致小鼠巨噬细胞中的白细胞介素表达降低,免疫力明显降低,存活率显著下降。甘氨酸又通过脱羧反应和甘氨酸脱氨-裂解酶系统被降解为对水产动物产生危害的NH3和CO2,降解产物与环境中的水反应,对鱼类产生不可逆转的伤害[53]。

对于普通市民来说，这种社会援助要求常常是像查找不准时的列车时刻表一样，保证病人按时赶上火车，找到朋友和亲人来照顾虚弱或是正在康复期的病人，或是为病人安排黄包车或是公交车作为交通工具。例如，有一次需要救护车护送一位病人去通州，但是通州超出了医院救护车的行使范围，我们便租了一辆公共汽车来充当救护车。

3.3 KEGG代谢通路互作网络

已有研究表明,物种表型多样性不是由单个分子标记或者基因决定的,而是由一组基因相互作用形成多种类型的分子网络所引起[54]。鱼类皮肤作为免疫器官,可通过多种信号通路及细胞因子来调节机体健康[55]。补体作为固有免疫系统的组成成分,可以介导机体的免疫应答和炎症反应[56-57],补体系统可以经过3条途径激活,而C3是这3条途径的中间的重要成分,且补体 C3 的激活是攻膜复合体形成的必要条件[58],因此,C3被认为是补体系统最关键的分子之一。而炎症是防御免疫的重要表现之一,杂交鲟在盐碱胁迫下,皮肤作为最大接触面积的组织,受到的水环境的刺激也将是最直接的,因此,在皮肤感染炎症后C3的裂解产物将毛细血管的通透性增加,使白细胞大量聚集到该部位[59],在转录组数据中显示C3的下调表达意味着杂交鲟在盐碱胁迫下,机体受到的刺激十分严重,且预计后期难以恢复。

MAPK(也称为ERK)通路是一个高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶系统[60],对不同刺激的不同响应,将细胞膜上的信号传递到细胞核中,其中包括细胞增殖、分化、生长、炎症和应激反应等生命活动[61]。研究发现,MAPK在低温、干旱、高盐高渗透和物理损伤的胁迫反应应答有关[62]。因此,在持续的盐碱环境中,杂交鲟MAPK通路经过被激活,经过三级激酶级联的形式(MAPKKK→MAPKK→MAPK)传导信号,然后被其特异性抑制剂抑制表达,从而阻止促炎介质的上调,改善杂交鲟的鱼体机能。

从西便门桥向北经北二环到东便门桥，全长16.5 km，中央隔离防撞墩采用特-4型钢筋混凝土防撞缘石，底宽50 cm，顶宽30 cm，外露40 cm。防撞墩上设置防眩板，高80 cm，宽10 cm，间距50 cm，通过螺栓直接锚固在防撞缘石上。防眩板两侧是方形钢护栏，高15cm，宽7cm，每隔1.5m通过螺栓固定在防撞缘石上方的立柱，如图3所示。

3.4 NaHCO3胁迫下对杂交鲟肾脏、皮肤的结构变化

鱼类在盐碱水环境中为了避免渗透压的失衡,能量的过度消耗和免疫功能的变化需要不断地改变自身的生理状态来维持鱼体环境的稳态[63-64]。鱼类皮肤和鳃作为鱼类黏膜层的重要组成部分,黑龙江水产研究所鱼类繁殖生理实验室前期结果显示,杂交鲟的鳃在碳酸氢钠胁迫下鳃小片发生卷曲、融合、鳃上皮细胞细胞出现增生和膨大,已经影响到杂交鲟的渗透调节和呼吸功能;在碳酸氢钠胁迫下,杂交鲟的皮肤发生了肉眼可见的损伤。Hellio等[65]和Fast等[66]研究已证实,黏液细胞分泌的黏液具有一些酶的活性,糖蛋白、免疫球蛋白以及一些抗细菌、真菌成分等。杂交鲟的黏液细胞数量随碱度的升高逐渐增多,表明其在应对盐碱环境时皮肤会分泌大量的黏液细胞至体表,形成其免疫防护的第一道屏障。

肾脏作为鱼类主要的渗透调节器官之一,在机体处于非等渗环境中,肾脏可以通过改变形态结构[67]、离子通道[68]以及离子转运蛋白的表达[69]和激素分泌水平[70]等来调整体内外渗透压的动态平衡。在碳酸盐胁迫下,杂交鲟通过肾脏对水环境的吸收以及尿液的重吸收来缓解因吞咽高渗水溶液造成的鱼体失水。在T2和T3组中可以明显看出,在非等渗环境中杂交鲟肾脏的过度损伤,肾小球管腔变窄,血流发生障碍,导致有效的血液循环受阻,肾小球的过滤能力下降。肾脏作为杂交鲟主要的免疫器官,在盐碱水环境中减缓鱼体损伤发挥着十分重要的作用,Tong等[71]对盐碱环境中的青海湖裸鲤的肾脏和鳃进行转录组测序发现了大量的免疫相关的候选基因也验证了这一结果。