唐 君,代 祥,李贵飞,,穆 兵,王 枫,杨亦扬

(1.江苏省农业科学院 休闲农业研究所,江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室,江苏 南京 210014; 2.南京农业大学 园艺学院,江苏 南京 210095)

茶树是叶用植物,生长过程中对氮肥的要求高。适宜的氮肥用量可以提高茶叶的产量和品质[1]。由于茶园管理粗放,施入的氮肥往往过量。据调查,我国有30%的茶园土壤氮肥施用过量[2]。不仅造成资源浪费,还会加剧土壤酸化和水体富营养化[3],同时对茶叶品质产生不利影响[4]。通过精准施肥和选用氮高效品种,可以显著提高茶园氮素利用率。研究表明,20年生的茗丰茶园,与习惯施肥相比,化学氮肥减施27.8%,产量不减[5]。筛选出黄棪对低氮不敏感,属于氮高效茶树品种[6]。

虽然目前关于NPF基因的研究已有较多报道,但大多集中在模式植物拟南芥、水稻中[9],而对于茶树中的NPF基因鉴定及功能研究报道较少。为探讨NPF蛋白在茶树氮素响应方面的功能,本研究克隆得到一个受氮素处理诱导表达的NPF转录本,根据其在茶树基因组上分布位置,将其命名为CsNPF5。对该基因进行了生物信息学分析,研究CsNPF5在不同氮素水平下的表达模式,以期为进一步研究CsNPF5基因功能、提高氮素利用率并选育氮高效茶树品种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.2 CsNPF5基因克隆

基于茶树基因组序列信息,设计CsNPF5基因全长扩增引物T1和T2(表1)在茶树gDNA中和cDNA中扩增NPF5基因序列,通过对PCR扩增产物进行电泳、切胶回收并连接到pMD18-T载体上,转化DH5α感受态细胞,经培养挑取阳性单菌落进行测序,并将测序序列在茶树基因组中检索验证该基因存在,即克隆CsNPF5基因全长。

表1 PCR扩增的引物序列Tab.1 Primer sequences of PCR amplification

1.3 CsNPF5基因染色体定位

利用克隆的CsNPF5基因序列,通过搜索茶树基因组数据库Tea Plant Information Archive(TPIA,http://tpdb.shengxin.ren/index.html),获得与CsNPF5基因序列完全匹配的基因组位置信息和基因ID,对CsNPF5进行全基因组染色体分布定位及基因拷贝数分析。

1.4 CsNPF5基因序列分析

利用DNAMAN进行不同物种中CsNPF5基因同源序列的多序列比对。用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)进行CsNPF5基因的开放阅读框(Open reading frame, ORF)预测。用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)在线工具进行CsNPF5蛋白保守域预测。用ExPASy Compute pI/MW(https://web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool)在线工具进行蛋白分子量和等电点计算。用CsNPF5蛋白序列在NCBI数据库中搜索其他物种中该蛋白的同源序列,用MEGA 10软件[20],将获得的同源序列以邻接法(Neighbor-joining,NJ;bootstrap=1 000)构建进化树。用TMHMM 软件(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)预测蛋白的跨膜结构域;用ProtComp 9.0(http://linux1.softberry.com)预测蛋白亚细胞定位。

1.5 CsNPF5基因表达分析

利用Primer 6设计目的基因特异性定量引物(T3和T4)。以茶树GAPDH[21]为内参基因(T5和T6),荧光定量反应体系TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa, Code No. RR820A) 10 μL,特异引物各1 μL(4 μmol/L),cDNA 模板1 μL(50 ng/μL),加双蒸水到7 μL,终体积 20 μL。充分混匀,短暂离心后,于 ABI7500 Fast 实时定量PCR仪上进行荧光定量PCR扩增,参数为:95 ℃ 3 min预变性;95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,72 ℃10 s,40个循环,每个循环结束时采集荧光信号,每个反应设3次生物学重复,2个技术重复,最后采用2-ΔΔCt法来计算基因相对表达量,并采用ANOVA进行Duncan′s多重比较分析,显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 茶树CsNPF5基因gDNA和cDNA序列的克隆

利用引物T1和T2分别在茶树叶片gDNA和氮素处理茶树叶片cDNA文库中,进行茶树CsNPF5基因gDNA和cDNA序列PCR扩增,PCR产物分别经1.5%的琼脂糖凝胶电泳,扩增产物长度在1 000～2 000 bp(图1),经测序确认,以gDNA为模板的PCR扩增,获得PCR扩增产物长度为2 096 bp,而以cDNA为模板,获得PCR扩增产物长度为1 440 bp。在NCBI数据库中用ORF Finder分析扩增基因序列的编码框,经检索ORF Finder分析测序,cDNA序列恰好包含一个完整基因编码框,即扩增基因cNDA全长为1 440 bp,编码479个氨基酸(图2)。通过拼接PCR扩增的基因gDNA和cDNA序列,指出该基因包含2个内含子和3个外显子(图3),经比对NCBI数据库发现该基因序列与中华猕猴桃NPF8.1(GenBank:PSS34634.1)具有较高的相似性,达79.54%,检索茶树基因组数据库(TPIA)NPF同源基因,发现该基因是位于茶树1号染色体上的第5个NPF基因,故将其命名为CsNPF5。

M.2000 bp DNA Ladder;1.以cDNA为模板目的基因PCR扩增产物;2.以gDNA为模板目的基因PCR扩增产物。M.2 000 bp DNA Ladder;1.The PCR amplification product,which was obtained by using cDNA as a template to amplify the target gene;2.The PCR amplification product,which was obtained by using gDNA as a template to amplify the target gene.图1 CsNPF5基因PCR扩增Fig.1 PCR amplification of CsNPF5 gene

阴影部分.指示PTR2结构域在CsNPF5蛋白上的分布;红色的ATG.起始密码子;*.终止密码子。Shaded area.Indicates the distribution of the PTR2 domain in CsNPF5 protein;Red ATG.Initiation codon;*.Termination codon.图2 CsNPF5基因序列特征Fig.2 Sequence characteristics of CsNPF5 gene

图3 CsNPF5基因结构Fig.3 Gene structure of CsNPF5

2.2 CsNPF5 的染色体定位

以gDNA为模板的PCR扩增的CsNPF5序列作为搜索序列,在茶树基因组数据库中进行Blast同源搜索,得到一个与CsNPF5基因序列完全相同的基因座(TEA015944.1)序列,获得CsNPF5基因座物理位置信息为Chr1:226371356—226373449(-),指出CsNPF5基因定位于茶树1号染色体上,且为单拷贝基因。

2.3 CsNPF5基因及其编码蛋白序列分析

开放阅读框分析指出,CsNPF5基因开放阅读框全长为1 400 bp,编码479个氨基酸,相对分子量53.12 ku,等电点7.13,包含一个PTR2保守结构域。基因结构分析指出,CsNPF5基因的3个外显子长度分别为540,48,844 bp,2个内含子大小为105,549 bp。InterPro在线工具对CsNPF5基因编码的蛋白质结构域分析表明,CsNPF5蛋白的第2—403位氨基酸具有NPF蛋白家族共有的PRT2保守结构域。对CsNPF5基因内含子的剪切位点进行分析,结果表明,该基因的内含子都符合经典的GT-AG剪切法则,且CsNPF5基因的PRT2结构域包含一个内含子,这与植物NPF基因的内含子分布模式一致。同时PSORT在线工具预测CsNPF5蛋白的亚细胞定位,结果指出CsNPF5蛋白定位于细胞质中,这表明该蛋白具有在植物细胞核外行使功能的潜力。同时TMHMM分析结果表明,CsNPF5蛋白具有7个跨膜区,符合NPF蛋白家族具有多跨膜区细胞核外行使功能的特征。

2.4 CsNPF5基因编码蛋白的同源性及系统进化分析

以CsNPF5蛋白的氨基酸序列为搜索序列,用Blast搜索NCBI数据库中与CsNPF5蛋白同源的蛋白,将搜索得到的不同物种中的同源蛋白用DNAMAN进行序列比对,发现CsNPF5蛋白与已报道的茶树(Camelliasinensis)、中华猕猴桃(Actinidiachinensis)、雷公藤(Tripterygiumwilfordii)、茸毛烟草(Nicotianatomentosiformis)、甜樱桃(Prunusavium)、辣椒(Capsicumannuum)、中华辣椒(Capsicumchinense)、毛果杨(Populustrichocarpa)、木薯(Manihotesculenta)、葡萄(Vitisvinifera)、野生番茄(Solanumpennellii)、马铃薯(Solanumtuberosum)、月季(Rosachinensis)和欧洲草莓(Fragariavesca)中的NPF蛋白均具有同源性,聚类分析指出,这些NPF蛋白可分三类,其中茶树CsNPF与中华猕猴桃NPF蛋白相似性较高,达79.54%,聚在同一进化支(图 4),进一步表明CsNPF5保守的PRT2结构与经典的植物NPF结构是一致的。

节点自展值小于50%不显示。The bootstrap values of nodes less than 50% is not displayed.图4 不同植物中CsNPF5同源蛋白的聚类分析Fig.4 Phylogenetic analysis of CsNPF5 orthologous proteins from different plants

2.5 氮素处理下茶树CsNPF5基因表达分析

不同小写字母表示不同氮素处理下CsNPF5表达差异达显著水平(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05)of CsNPF5 expression under different nitrogen treatments.图5 不同氮素处理下CsNPF5的相对表达模式Fig.5 Expression patterns of CsNPF5 gene under different nitrogen treatments

3 结论与讨论

植物中转运硝态氮的基因家族成员,功能不尽相同。PtNRTs基因在白杨的不同组织具有不同的表达模式,表明这些基因在白杨代谢过程中起着不同的作用[22]。硝态氮诱导能够激活或抑制转运蛋白家族中成员的表达。在拟南芥的根和叶中,AtNRT1.1、AtNRT2.1和AtNRT2.2能够被硝态氮强烈诱导表达,AtNRT2.4虽被诱导,但是表达量差异不显著,AtNRT2.5的表达则会被氮素抑制[23]。茶树中,硝态氮诱导下,CsNRT1.1和CsNRT1.2幼嫩叶中表达量上升,CsNRT1.7在成熟叶中表达量上升,CsNRT2.4则会在根中大量表达[18]。本试验结果表明,CsNPF5在叶中的表达受到硝态氮的诱导。且硝态氮浓度越高,CsNPF5达到表达量的顶峰的时间就越快。硝态氮浓度越高,可能硝态氮受体就越容易感受到硝态氮信号,作为下游基因的CsNPF5表达也更快。目前,对植物感受硝态氮信号并作出响应的机制的研究已取得很大的进展。环核苷酸门控通道(CNGC)是动植物中普遍存在的离子通道[24]。拟南芥中,NRT1.1蛋白与CNGC15蛋白在质膜上形成复合物,抑制CNGC15的Ca2+通道活性,NRT1.1感受到外界硝态氮信号后,NRT1.1-CNGC15复合物解离,CNGC15恢复正常功能,钙离子内流,随之,转录因子NLP7被蛋白激酶磷酸化,进入细胞核激活一级硝态氮响应[25]。一般可认为外界1 mmol/L的硝态氮浓度是硝酸盐转运蛋白高低亲和系统转换的分界线[26]。本试验中,在0.2,10 mmol/L的NO3-离子处理下,CsNPF5基因表达量都出现了一定程度的上调。说明该基因可能是双亲和的硝态氮转运蛋白。

茶树CsNRT2.4基因在拟南芥中过表达,可以增加拟南芥的根长、鲜质量以及根在低氮素水平下的氮素吸收效率,提高氮素利用率[18]。CsNRT2.4和CsNRT3.2在中茶108和龙井43均会被硝酸盐诱导表达,但与中茶108相比,龙井43中的CsNRT2.4和CsNRT3.2表达量更高,说明龙井43的对外界氮素的响应更快[27]。有研究表明,龙井43属于氮高效茶树品种[28]。说明CsNRT2.4和CsNRT3.2表达量可以反映某一茶树品种硝态氮的吸收能力[27]。对CsNPF5是否能反映某一茶树品种的硝态氮吸收能力,还有待进一步研究。不过NO3-的吸收转运调控是一个相当复杂的过程,涉及同化、运输和信号传递的多个相互关联的步骤,往往通过几个基因的表达量的差异看不出该品种是否为氮高效的茶树品种。因此,为了选育耐低氮和氮高效的茶树品种,还需要对硝态氮转运的基因或者蛋白进行系统的研究。