王 莹,王晓宇,孙德慧,霍红雁,刘海臣,徐 惠,张继星

(内蒙古民族大学 生命科学与食品学院,内蒙古 通辽 028000)

目前,土壤盐分是植物最主要的非生物胁迫之一,土壤盐渍化日益严重,已经成为影响我国农业发展的主要因素[1]。土壤盐渍化问题在我国干旱半干旱地区表现得尤为严重,且体现出盐渍化程度高、盐碱地分布范围广、种类复杂多样的特点,严重阻碍了土地地力的提升,且对我国土地的利用产生了巨大危害[2]。据不完全统计,世界盐碱地面积超过900万hm2,占干旱和半干旱地区总面积的39%,几乎占世界陆地面积的6.5%[3]。与此同时,随着人类活动对自然环境产生的影响,伴随着不合理的灌溉与施肥等农事操作也使得土壤盐渍化面积正在逐年增加[4]。植物有多种方式抵御盐胁迫,其中钙依赖蛋白激酶(CDPK)利用多种信号途径参与调控离子通道相关基因的表达和调整气孔运动来适应植物对盐的耐受性。目前,已经在植物提取物中发现的大量钙刺激的蛋白激酶活性就与CDPKs相关,它可解码植物体内的Ca2+信号,从而提高蛋白激酶活性[5]。有研究表明,在过量表达的植物中,拟南芥钙依赖蛋白激酶基因AtCPK6中几种胁迫调控基因的表达水平发生了变化从而提高了对盐胁迫的耐受性[6]。CDPK可以通过调节ABA信号传导和减少活性氧(ROS)的积累来正向或负向调节盐胁迫耐受性[7]。蓖麻(Ricinuscommunis)是大戟科蓖麻属一年生或多年生草本植物,具有很高的利用价值,其籽油中含有丰富的蓖麻油酸,在航空航天和工业上有着广泛的应用[8]。蓖麻还具有耐瘠薄、耐干旱、耐盐碱、适应性强的特点,可以在贫瘠的边际土地上生长,不与粮争地,并能作为土壤改良作物,有效解决我国现阶段耕地面积不足和土壤盐碱化等问题[9-11]。本研究基于蓖麻转录组信息,克隆蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29)并分析其在盐处理下的表达量,同时对该基因进行生物信息学分析,构建RcCDPK29双元表达载体,以期为研究RcCDPK29基因的生物学功能提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为蓖麻哲蓖3号,该品种是通辽市农业科学研究院育成的高产抗病优良品种。将蓖麻种子置于腐殖质土壤待长至二叶期时,用300 mmol/L盐处理 0,2,6,8,12,24 h 后,分别取根、茎、叶置于液氮中速冻,-80 ℃ 超低温冰箱保存备用。

1.2 植物总RNA的提取及cDNA合成

总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR 高保真酶购自大连宝生物 (TaKaRa)公司,胶回收试剂盒、2×Es Taq Master Mix 购自康维世纪公司,其余试剂均为国产分析纯。

1.3 蓖麻RcCDPK29基因的克隆

通过对蓖麻转录组数据库检索,获得候选RcCDPK29全长序列,根据其CDS序列设计特异性引物RcCDPK29-F、RcCDPK29-R(表1),并加入表达载体酶切位点,由北京六合华大基因公司合成。参照购自北京康为世纪生物科技有限公司的2 × Es Taq Master Mix 说明书进行PCR扩增反应,体系及程序条件见表2。利用购自北京索莱宝科技有限公司的0.2%琼脂糖凝胶电泳检测、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带,连接至pMDTM19-T Simple Vector,转化到大肠杆菌Top10感受态中,涂于蓝白斑筛选培养基后挑取单菌落,PCR检测阳性菌送至北京六合华大基因公司测序。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

表2 PCR反应体系及条件Tab.2 PCR reaction system and conditions

1.4 序列分析

使用DNAMAN软件获得RcCDPK29CDS序列所对应的氨基酸序列。在NCBI和InterProScan 上进行蛋白保守结构域预测(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi,https://www.ebi.ac.uk/interpro/);通过DNAMAN软件对该蛋白基本理化性质进行分析;SOMPA在线工具分析该蛋白二级结构(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa%20_sopma.html);通过ProtScale Sever在线软件分析该蛋白的疏水性(https://web.expasy.org/protscale/);通过SWISS-MODEL在线软件分析该蛋白的三级结构(https://swissmodel.expasy.org/);结合NCBI-Blast在线搜索与RcCDPK29相似度较高的其他蛋白序列,并利用DNAMAN软件进行序列相似性比对。TMHMM Server v.2.0软件预测RcCDPK29蛋白是否存在跨膜结构域(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)。

1.5 植物表达载体构建

将测序成功的阳性菌液进行扩摇,提取质粒后,应用限制性内切酶SmaⅠ和XbaⅠ将该质粒与表达载体pCG-3300进行双酶切,T4连接酶酶切产物,转化到大肠杆菌感受态Top10细胞中,通过Kan抗性筛选阳性菌,扩摇后提质粒,进行重组质粒PCR鉴定和双酶切鉴定,酶切体系见表3。0.1%琼脂糖凝胶电泳检测、回收目的条带,并在反应条件为16 ℃下过夜连接,连接体系见表3。用热激法将10 μL连接产物转入大肠杆菌Top10感受态中,涂板培养过夜后挑取单菌落,37 ℃ 180 r/min振荡培养4 h,利用菌液PCR阳性菌进行双酶切鉴定。

表3 双酶切体系及连接体系Tab.3 Double enzyme digestion system and ligation reaction system

1.6 荧光定量PCR分析

根据测序获得的RcCDPK29碱基序列,应用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物qRcCDPK29(表1)。以蓖麻RcSKIP和RcADP基因为内参,检测蓖麻根、茎、叶中RcCDPK29在盐处理条件下0,2,6,8,12,24 h的表达量,PCR反应程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,40个循环;72 ℃ 30 s。循环后增加熔解曲线。每个样品3次重复,用2-ΔΔCT方法计算基因相对表达量[12]。

2 结果与分析

2.1 蓖麻RcCDPK29的全长获得与序列分析

以哲蓖3号蓖麻叶片cDNA为模板,PCR扩增并测序后获得1 590 bp的CDS序列(图1),编码528个氨基酸(图2)。结合NCBI和InterProScan[13]在线预测工具对蓖麻RcCDPK29蛋白的保守结构域进行分析(图3),RcCDPK29蛋白具有5个保守结构域,分别是在81—338位的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域和 4个EF-hand钙结合结构域 (385—413,421—449,457—485,492—520)。结合DNAMAN软件对6个植物一致性较高的钙依赖蛋白激酶CDPK29氨基酸序列进行比对分析(图4),蓖麻(Ricinuscommunis)的RcCDPK29氨基酸序列与毛果杨(Populustrichocarpa)、石榴(Punicagranatum)、麻疯树(Jatrophacurcas)、巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)、木薯(Manihotesculenta)、柑橘(Citrussinensis)的CDPK29氨基酸序列一致性均在75%以上,其中与麻疯树一致性最高,为82.29%。

M．DL2000 DNA Marker;1—2．PCR结果。图9—10同。M．DL2000 DNA Marker;1—2．PCR results．The same as Fig.9—10.图1 蓖麻RcCDPK29基因 PCR 扩增产物Fig.1 PCR products of RcCDPK29 gene in Ricinus communis

方框.EF-hand结构域。The boxes.EF-hand domains.图2 RcCDPK29 基因CDS序列推导的氨基酸序列Fig.2 RcCDPK29 CDS sequence and its deduced amino acid sequence

图3 RcCDPK29蛋白保守区预测Fig.3 Prediction of RcCDPK29 conserved domains

图4 蓖麻与其他植物CDPK29序列一致性对比Fig.4 Identity comparison of CDPK29 sequences between Ricinus communis and other plants

2.2 RcCDPK29理化性质和蛋白结构分析

对蓖麻RcCDPK29基因进行理化性质预测分析,该基因编码的蛋白分子量为59.74 ku,等电点(pI)值为6.21。该蛋白由228个α-螺旋、45个β-转角、203个无规则卷曲以及52个延伸链构成,α-螺旋在该蛋白中起重要作用(图5)。使用SWISS-MODEL[14]在线软件预测蓖麻RcCDPK29蛋白的三级结构。同源建模结果显示(图6),RcCDPK29与拟南芥CDPK(SMTL ID:3q5i．1)相似度为40.41%,具有较高可信度(>30%)。经TMHMM[15]在线软件预测分析RcCDPK29不存在跨膜结构域,是典型的非跨膜蛋白(图7)。利用ProtScale Sever[16]在线软件分析蛋白疏水性显示,RcCDPK29蛋白的528个氨基酸中,最大的亲水性系数为2.778,最小的亲水性系数为-3.133,平均亲水性系数为-0.355,进一步表明该蛋白属于亲水性蛋白(图8)。

h．α-螺旋;e．延伸链;t．β-转角; c．无规则卷曲。h． Alpha helix;e．Extended strand;t．Beta turn;c．Random coil．图5 RcCDPK29蛋白结构预测Fig.5 Secondary structure prediction of RcCDPK29

图6 RcCDPK29蛋白的三级结构Fig.6 RcCDPK29 protein tertiary structure prediction

图7 RcCDPK29蛋白的跨膜结构预测Fig.7 Transmembrane structure prediction of RcCDPK29 protein

图8 RcCDPK29蛋白的疏水性分析Fig.8 Hydrophobic analysis of RcCDPK29 protein

2.3 RcCDPK29双元表达载体构建及鉴定

琼脂糖凝胶电泳结果(图9)显示,重组质粒明显大于酶切后表达载体电泳条带,酶切后目的片段大小与RcCDPK29序列大小一致(图10),植物表达载体构建成功。

图9 表达载体重组质粒检测Fig.9 Expression vector recombinant plasmid assay

图10 表达载体双酶切鉴定Fig．10 Expression vector double digestion detection identification

2.4 RcCDPK29在不同组织和不同胁迫时间的表达分析

对蓖麻根、茎、叶进行多时间点组织特异性分析,由图11可知,RcCDPK29基因主要在茎中表达,盐处理12 h表达量最高。随着盐处理时间的延长,RcCDPK29基因根的表达量逐渐下降,分别在2,8,24 h达到最低,与0 h差异显著;叶在2 h的表达量最低且与0 h相比差异显著。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference.图11 RcCDPK29 在蓖麻根(A)、茎(B)、叶(C)中不同处理时间的表达量测定Fig.11 Determination of expression of RcCDPK29 at different processing times in Ricinus communis root(A),stem(B),leaf(C)

3 结论与讨论

CDPK对植物抗盐胁迫有正调节的作用[17-18],其下游的信号通路与多种信号转导途径有着复杂而紧密的联系。CDPK作为一种直接受钙离子调节的蛋白激酶,在信号通路中处于关键位置。研究证明,CDPK通常以单肽链形式存在,结构高度保守,从肽链的N端到C端存在4个功能区结构域,依次为可变区、催化区、连接区和调控区[19]。每个结构域的氨基酸数量、同源性和功能都不同。其中,催化区和连接区同源性都比较高,催化区又称蛋白激酶区,具有典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶保守序列。连接区也有很重要的功能,当缺乏Ca2+时,连接区可能会与催化区结合,导致蛋白激酶活性被抑制。调控区是CDPK基因区别于其他激酶特有的区域,具有与钙离子结合的EF-hand钙结合结构域[20]。本研究对获得的RcCDPK29基因序列进行分析后发现,该序列包含有典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域以及EF-hand钙结合结构域。蛋白激酶区的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域中81—338位氨基酸处是蛋白激酶结构域,为催化区,是所有CDPK蛋白中都具有的典型亚结构[17],201—213 位氨基酸处的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性域处于该区域中;调控区在385—520位氨基酸附近,包括385—413,421—449,457—485,492—520个氨基酸处的4个EF-hand钙结合结构域,是钙结合区,也是CDPK有别于其他类激酶的特有区域[21],其结构和功能类似于钙调素(CaM)的氨基酸序列,这是CDPK对Ca2+高度亲和而不依赖于钙调素的原因[19]。

蓖麻为适应各种外界环境刺激形成了复杂的逆境胁迫信号传导机制,其中Ca2+作为第二信使主要参与植物非生物胁迫信号的传导,Ca2+通过钙结合蛋白介导将胁迫信号传递到调控通路的下游,钙依赖蛋白激酶(CDPK)作为钙结合蛋白之一在植物抵抗逆境胁迫的调控反应中发挥着重要作用[22]。从蓖麻中分离得到了RcCDPK29基因,利用生物信息学方法对该基因分析后发现它与其他6个物种的CDPK家族成员在氨基酸序列和蛋白结构上存在较大的相似性,具有CDPK家族典型的类钙调素结合域,这也是CDPKs与其他类型蛋白激酶存在区别的区域[23]。CDPK普遍存在于植物体的各个细胞、组织或器官[24-26]。有些CDPK在植物中广泛表达,有些在器官或组织中表达程度不同,甚至特异性不同。RcCDPK29基因的表达具有组织特异性,这一表达特性也存在于其他植物中的CDPKs,例如小麦TaCDPK13基因在叶、幼穗以及未成熟的种子中表达,而在根、茎中则未见表达[27];拟南芥AtCPK17和AtCPK34基因主要在花粉管形成期表达,并参与调控花粉管的生长[28];水稻OsCDPK6基因在花粉管形成阶段转录水平上调[29];油菜BnCDPK1在叶片中的表达水平最高,在油菜花中的表达水平很低,在种子等其他组织中的表达水平则中等[30];在甜瓜中除CmCDPK3外,所有鉴定出的CmCDPK均在根、茎、叶、雄花和卷须这5种组织中至少有一种表达,部分CmCDPK在雄花中高表达[31]。

本研究在蓖麻转录组数据基础上,克隆RcCDPK29基因,构建双元表达载体,分析该基因理化性质,并预测RcCDPK29蛋白的二级、三级结构,结果表明,蓖麻RcCDPK29与麻疯树等6个植物CDPK29的氨基酸序列具有较高一致性。蓖麻CDPK基因序列的生物信息学分析结果表明, RcCDPK为亲水蛋白,无跨膜结构域。氨基酸序列包含5个结构域,1个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域和 4个EF-hand钙结合结构域。通过qRT-PCR分析发现,RcCDPK29主要在蓖麻的茎和叶中表达。本研究为进一步明确蓖麻耐盐调控机制奠定了基础,对探索蓖麻抵御盐胁迫的机制具有一定借鉴意义。