王亚丽,魏琦超,李成伟

(1.河南科技学院 生命科技学院,河南省粮食作物基因组编辑工程技术研究中心,河南 新乡 453003; 2.河南工业大学 生物工程学院,河南 郑州 450001)

玉米(Zeamays)起源于美洲大陆,栽培历史悠久,与水稻(Oryzasativa)、小麦(Triticumaestivum)合称为我国三大粮食作物,2021年国家统计局对全国31 个省(区、市)的统计结果表明,在播种面积和总产量2 项指标上,玉米均居粮食作物首位,分别为4 332.41万hm2、27 255.2万t。玉米具有类型多、用途广、产量高、分布广的特点,集粮(粮食)、经(经济)、饲(饲料)3种用途于一身,开发潜力大[1]。

植物生物反应器(Plant bioreactor)是指利用植物细胞、组织、器官或整株植株大量生产具有重要功能的蛋白质或次生代谢产物等[2]。就药用或饲用等蛋白质的异源表达而言,以使用种子特异性启动子驱动目标蛋白基因在受体植物种子中特异性表达为典型特征的种子生物反应器,除具有植物生物反应器的一般优点(如成本低、易扩大、安全性好等[3])外,还具有以下优势:①种子在成熟过程中,含水量逐渐下降,蛋白酶活性也随之降低,有助于外源蛋白的积累。待种子成熟,蛋白质可在种子中长期保存且不影响活性,便于运输和贮存[4]。②若种子本身可用作食物来源或饲料,则转基因种子生产的蛋白质可以在没有纯化的情况下使用,进而降低生产成本[5]。③外源蛋白在种子中特异性积累,一般不影响营养器官的生长[6]。

玉米、水稻等禾本科(Poaceae)植物的种子实际是其果实,植物学上称为颖果(Caryopsis),俗称籽粒(Grain)[7]。近年来,籽粒生物反应器研究领域取得了诸多进展:用水稻胚乳特异性启动子Gt13a驱动人血白蛋白(Human serum albumin,HSA)在水稻籽粒中表达,该植物源性制品在理化性质、生物学活性方面与传统血源性制品一致[8];以玉米胚乳特异性启动子Leg1A驱动植酸酶基因在玉米籽粒中表达,籽粒可直接用于饲料加工,无须对其进行纯化等,降低了饲料成本[9];通过籽粒特异性启动子驱动花青素(Anthocyanin)合成途径相关基因的特异性表达,在水稻、玉米籽粒中均成功实现了花青素的积累[10-11]。

籽粒特异性启动子是构建目标基因表达载体,开展籽粒生物反应器研究的前提条件之一。Qu等[12-13]以已知的水稻贮藏蛋白基因为切入点,克隆了GluB-4、GluC等多个水稻胚乳特异性启动子。近年来,随着转录组学(Transcriptomics)数据的日益丰富,基于基因表达数据开展特异性启动子的发掘工作,已有成功案例[14]。玉米表达谱芯片数据(Expression profile microarray)已于2011年公布[15],本研究拟对该数据进行分析,综合考虑基因在不同组织器官、发育时期的转录本丰度,筛选出玉米籽粒高转录本丰度基因,克隆其编码区上游序列并开展功能鉴定工作,以期获得未报道的籽粒特异性启动子,为玉米、水稻等禾本科植物籽粒生物反应器的载体构建流程提供候选启动子资源。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 玉米自交系B104、水稻自交系中花11、拟南芥(Arabidopsisthaliana)哥伦比亚生态型(Columbia 0,Col0),其种子均由河南省粮食作物基因组编辑工程技术研究中心保存。

1.1.2 质粒、菌株和分子生物学试剂 大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5α由本中心提供,根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105、GV3101(pMP90)感受态细胞购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

载体pMD19-T Vector购自宝生物工程(大连)有限公司,pCAMBIA1301(PCaMV35S∷GUS∷Tnos)、pENTRY(PCaMV35S∷GUS∷T35S)、pEarleyGate303均由本中心保存。

Flying SharkTMUniversal Plant RNA Isolation Kit(DNase I)购自北京诺贝莱生物科技有限公司,PrimeScriptTMⅡ 1stStrand cDNA Synthesis Kit、PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase 购自宝日医生物技术(北京)有限公司,Phire Plant Direct PCR Kit购自赛默飞世尔科技公司,pEASY®-Blunt Zero Cloning Kit、EasyScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司,HiPure SF Plant DNA Mini Kit购自上海玉博生物科技有限公司,Super-Bradford Protein Assay Kit购自康为世纪有限公司,MonAmpTMSYBR® Green qPCR Mix、MonCloneTMHi-Fusion Cloning Mix V2购自莫纳(武汉)生物科技有限公司,NotⅠ、AsiS Ⅰ、EcoR Ⅰ、NcoⅠ等限制性核酸内切酶购自NEB(北京)有限公司,Gateway® LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix购自Invitrogen life technology公司(美国)。

1.2 试验方法

1.2.1 高丰度籽粒特异性表达基因的表达谱分析 通过对玉米表达谱芯片数据的分析,发现GRMZM2G006585在授粉后2,4 d等12 个不同发育时期籽粒中的表达量明显高于其在根、茎、叶等营养器官中的表达量,故选择该基因为研究对象。为了进一步明确该基因在不同组织(器官)中的表达量,利用Primer 6.0软件,设计玉米组成型内参基因(ZmTubulin[16]、ZmGAPDH[4])及GRMZM2G006585的特异性引物(表1)。收集大田种植的长势一致且生长状况良好的玉米根、茎、叶、花药、花粉、苞叶、花丝、穗轴、不同时期的籽粒等组织(器官),提取其总RNA,对获得的RNA溶液进行定量,取2.5 μg RNA采用PrimeScriptTMⅡ 1stStrand cDNA Synthesis Kit反转录为cDNA。以cDNA为模板,采用常规PCR技术分析待研基因的表达模式,并与公开的表达谱数据进行比较,判断待研基因是否为籽粒特异性表达基因。

表1 表达谱分析用引物Tab.1 Primers for expression profile analysis

1.2.2 高丰度籽粒特异性表达基因在籽粒不同发育时期的转录本丰度分析 为了评估GRMZM2G006585的表达量,以ZmTubulin为内参,选择已报道的玉米籽粒特异性表达基因ZmZein27[17]、ZmLeg1[18]为对照,对玉米籽粒不同发育时期GRMZM2G006585进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析。ZmTubulin、GRMZM2G006585引物同表1,其余基因qRT-PCR引物见表2,产物长度为80～150 bp。以玉米籽粒不同发育时期的cDNA为模板,采用MonAmpTMSYBR® Green qPCR Mix试剂盒进行qRT-PCR分析。

表2 实时荧光定量PCR引物Tab.2 Real time fluorescence quantitative PCR primers

1.2.3 籽粒特异性表达基因编码区上游序列的顺式作用元件注释 以苗期的玉米叶片为材料,参照HiPure SF Plant DNA Mini Kit说明书提取玉米基因组DNA。根据Ensembl database(http://plants.ensembl.org/)网站公布的基因序列信息,以玉米基因组DNA为模板,对GRMZM2G006585编码区上游序列进行克隆。利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和New PLACE(https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action)等网站的在线工具,对GRMZM2G006585编码区上游序列进行启动子顺式作用元件预测。

1.2.4 启动子序列驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)表达载体的构建(水稻遗传转化用) 将GRMZM2G006585编码区上游序列参照pMD19-T Vector Cloning Kit说明书连接至pMD19-T Vector克隆载体,以测序无误的克隆载体为模板,上游、下游引物均添加表达载体同源序列的18个碱基,对GRMZM2G006585编码区上游序列进行PCR扩增并切胶回收。参考MonCloneTMHi-Fusion Cloning Mix V2试剂盒的说明书,将回收后的目的片段连入用EcoR Ⅰ/NcoⅠ双酶切切除PCaMV35S启动子的pCAMBIA 1301(PCaMV35S∷GUS∷Tnos)载体。将测序正确的重组载体命名为pCAMBIA 1301(promoter∷GUS∷Tnos)。

1.2.5 根癌农杆菌工程菌株的获得及水稻的遗传转化 将构建好的pCAMBIA 1301(promoter∷GUS∷Tnos)载体采用冻融法转入农杆菌EHA105感受态细胞,标记为EHA105[pCAMBIA 1301(promoter∷GUS∷Tnos)]。将根癌农杆菌工程菌株交由武汉伯远生物科技有限公司进行水稻的遗传转化及转基因植株的鉴定工作,其中水稻遗传转化具体参考Yang等[19]的方法进行。

1.2.6 启动子驱动GUS在水稻中表达的组织化学染色分析 参考Qu等[12]的组织化学染色方法进行GUS活性检测。

1.2.7 启动子序列驱动GUS表达载体的构建(拟南芥遗传转化用) 以测序无误的克隆载体为模板,上游、下游引物均添加入门载体同源序列的18个碱基,对GRMZM2G006585编码区上游序列进行PCR扩增并切胶回收。用AsiS Ⅰ/NotⅠ对入门载体pENTRY(PCaMV35S∷GUS∷T35S)进行双酶切,把启动子片段PCaMV35S切除,通过琼脂糖凝胶电泳将条带分离,切胶回收载体骨架。参考MonCloneTMHi-Fusion Cloning Mix V2试剂盒方法,将启动子序列与载体骨架进行连接,重组载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑单克隆菌落进行菌液PCR鉴定,对阳性克隆测序。将测序正确的重组载体命名为pENTRY(promoter∷GUS∷T35S)。参考Gate way® LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix试剂盒说明书将入门载体pENTRY(promoter∷GUS∷T35S)与目的载体pEarleyGate303进行LR重组反应,获得植物表达载体pEXPR(promoter∷GUS∷T35S)。

1.2.8 根癌农杆菌工程菌株的获得及拟南芥的遗传转化 将植物表达载体pEXPR(promoter∷GUS∷T35S)采用冻融法转化至根癌农杆菌GV3101感受态细胞,记为GV3101[pEXPR(promoter∷GUS∷T35S)]。参考Clough等[20]的方法进行野生型拟南芥的遗传转化及转基因拟南芥的筛选工作。

1.2.9 启动子驱动GUS在拟南芥中表达的酶活性检测 参考Brissonnet等[21]的荧光测定法进行GUS活性的检测。

1.2.10 数据分析 采用Excel 2010软件进行数据分析,GraphPad软件作图,SPSS软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 GRMZM2G006585在不同组织(器官)的转录本丰度

下载玉米自交系B73的表达谱芯片数据,综合考虑各基因在不同组织器官、发育时期的转录本丰度,筛选出1个在籽粒中优势表达的基因(GRMZM2G006585)作为研究对象。为了验证该基因相关数据的准确性,以在玉米不同组织均稳定表达的ZmTubulin、ZmGAPDH为内参基因,对GRMZM2G006585在玉米B104的根、茎、叶等不同组织(器官)中的表达情况进行分析。结果表明,GRMZM2G006585仅在授粉后18 d的籽粒中表达,而在根、茎、叶等器官中未见表达(图1)。

R、ST、L、A、PO、H、SI、C、G分别代表根、茎、叶、花药、花粉、苞叶、花丝、穗轴、授粉后18 d的籽粒。R,ST,L,A,PO,H,SI,C and G respectively represent root,stem,leaf,anther,pollen,husk,silk,cob and grain at 18 days after pollination.图1 RT-PCR检测不同组织(器官)中GRMZM2G006585基因的转录本丰度Fig.1 Transcriptional abundance of GRMZM2G006585 in different tissues(organs)detected by RT-PCR

2.2 GRMZM2G006585在籽粒不同发育时期的转录本丰度

考察启动子来源基因在籽粒不同发育时期的转录本丰度,可初步预测该启动子是否具有较强的驱动下游基因转录的活性。以授粉后不同时期的玉米籽粒cDNA为模板,以ZmTubulin为内参基因,采取qRT-PCR技术检测GRMZM2G006585基因在玉米籽粒不同发育时期的转录本丰度(图2)。已报道的籽粒特异性启动子PZmZein27来源基因ZmZein27,其转录本在各发育时期相较于其他基因均表现出较高的丰度,在授粉后32 d,转录本丰度达到最高,几乎是ZmLeg1的400倍,初步猜测PZmZein27启动子为高转录活性的籽粒特异性启动子;在籽粒发育中期GRMZM2G006585的转录本丰度较ZmLeg1高,初步猜测可能会得到一个比PZmLeg1启动子转录活性更高的启动子。在籽粒发育过程中,不同基因表现出不同的表达模式:GRMZM2G006585主要在发育中期表达;ZmLeg1和ZmZein27主要在发育中后期表达。

DAP3,6,9,12,18,24,32分别代表授粉后3,6,9,12,18,24,32 d。DAP3,6,9,12,18,24,32 represent 3,6,9,12,18,24,32 days after pollination,respectively.图2 qRT-PCR检测籽粒不同发育时期GRMZM2G006585基因的相对转录本丰度Fig.2 Relative transcript abundance of GRMZM2G006585 at different stages of grain development detected by qRT-PCR

2.3 GRMZM2G006585编码区上游序列的启动子顺式作用元件分析

类别Ⅱ(Class Ⅱ)启动子涉及众多编码蛋白质基因的转录调控,通常位于该基因编码区的上游且富含转录调控元件。为了初步判断GRMZM2G006585编码区上游序列是否具备启动子功能,对GRMZM2G006585编码区上游序列进行克隆,GRMZM2G006585编码区上游序列经 PCR 扩增出大小为 1 987 bp 的条带(图3),对所克隆DNA序列进行了启动子顺式作用元件的检索工作。结果表明(图4),该基因编码区上游序列除了含有基本启动子元件TATA box和转录起始位点外,还含有ABRE、A/T rich element、E-box等多个籽粒特异性启动子相关顺式作用元件[22],初步判断所克隆的玉米籽粒特异性基因编码区上游序列具有籽粒特异性启动子功能,将该编码区上游序列命名为PZm2G006585。

M.DNA 标准分子量DL5000+;1. PZm2G006585。M.DNA standard molecular weight DL5000+; 1.PZm2G006585.图3 GRMZM2G006585编码区上游序列克隆Fig.3 Cloning of upstream sequence of GRMZM2G006585 coding region

下划线表示顺式作用元件,+1表示转录起始位点。Cis-acting elements are indicated by underscores,and the transcription site is indicated by +1.图4 GRMZM2G006585编码区上游序列启动子顺式作用元件分析Fig.4 Promoter cis-acting element analysis of upstream sequence of GRMZM2G006585 coding region

2.4 PZm2G006585驱动GUS在转基因水稻中的组织(器官)表达分析

相对玉米而言,水稻具有转化率高、周期短、遗传转化体系成熟等优点。为了更迅速地验证所克隆启动子是否为籽粒特异性启动子,利用同为禾本科植物的水稻对其进行验证。将构建好的植物表达载体EHA105[pCAMBIA 1301(promoter∷GUS∷Tnos)]进行水稻愈伤遗传转化,得到转基因苗后,对T0转基因水稻组织(器官)和T0转基因水稻的籽粒(T1籽粒)进行GUS组织化学染色观察。

经染色,组成型启动子Pubi着色正常(图5-A1—D1),缺失启动子未着色(图5-A2—D2),说明所采用的水稻材料GUS组织化学染色方法可靠。PZm2G006585驱动GUS转基因水稻的根、茎、叶、花等器官未见蓝色(图5-A3—D3)。作为本研究的阳性对照启动子,POsGluB-4(图5-A4—D4)和PZmZein27(图5-A5—D5)、PZmLeg1(图5-A6—D6)虽然分别为已报道的水稻和玉米胚乳特异性启动子[23-24],但POsGluB-4和PZmZein27转基因植株茎段仍有一定程度的着色(图5-B4—B5)。参照Russell等[17]研究,仍将此类启动子定义为胚乳特异性启动子。

A.根;B.茎;C.叶;D.花。1.Pubi;2.缺失启动子;3.PZm2G006585;4.POsGluB-4;5.PZmZein27;6.PZmLeg1。A.Root; B.Stem; C.Leaf;D.Flower. 1.Pubi; 2.Promoter deletion;3.PZm2G006585; 4.POsGluB-4; 5.PZmZein27; 6.PZmLeg1.图5 T0转基因水稻多个器官的GUS染色Fig.5 GUS staining of multiple organs in T0 generation of transgenic rice

为了研究各启动子驱动GUS在转基因水稻籽粒发育不同阶段的表达模式,以组成型启动子Pubi为阳性对照(图6-A1—G1),缺失启动子载体转基因材料(图6-A2—G2)为阴性对照,分别取各启动子T0转基因水稻开花后3 d(籽粒开始发育)、7 d(籽粒纵向发育到达颖壳顶部)、12 d(籽粒横向发育完全充盈颖壳)、40 d(籽粒成熟)的籽粒材料进行GUS染色。

A.DAF 3(开花后3 d)颖壳;B.DAF 7 颖果;C.DAF 7 颖壳;D.DAF 12 颖果;E.DAF 12 颖壳;F.DAF 40颖果;G.DAF 40颖壳。1.Pubi;2.缺失启动子;3.POsGluB-4;4.PZmZein27;5.PZmLeg1;6.PZm2G006585。A.Testa(3 days after flowering, DAF 3); B.Caryopsis(DAF 7);C.Testa(DAF 7); D.Caryopsis (DAF 12); E.Testa(DAF 12); F.Caryopsis(DAF 40); G.Testa(DAF 40) .1.Pubi; 2.Promoter deletion; 3. POsGluB-4; 4.PZmZein27; 5.PZmLeg1; 6.PZm2G006585.图6 转基因水稻T1籽粒不同发育阶段的GUS染色Fig.6 GUS staining in different developmental stages of T1 generation grains of transgenic rice

本研究将POsGluB-4[23]作为水稻内源胚乳特异性启动子对照,GUS染色结果表明(图6-A3—G3),虽然该启动子在水稻成熟籽粒的胚乳中特异性表达,但未成熟籽粒的颖壳中,其也具有驱动下游基因转录的活性,颖壳材料显示不同程度的蓝色。PZmZein27、PZmleg1在籽粒发育各阶段的颖壳和颖果中均具有启动子活性(图6-A4—E4、A5—E5),就成熟籽粒而言,其可驱动GUS在胚乳组织中优势表达(图6-F4—G4、F5—G5)。

PZm2G006585可驱动GUS在未成熟籽粒的颖壳和颖果中表达(图6-A6—F6),在成熟籽粒的颖壳中未检出GUS活性(图6-G6);就成熟籽粒的颖果而言,其驱动GUS在胚中的着色深度明显高于胚乳组织(图6-F6)。结合图5及前人关于胚乳特异性启动子的研究结果,认为PZm2G006585驱动外源基因表达的模式为籽粒特异、胚优势表达。

为了较为精细地考察PZm2G006585在水稻籽粒不同发育阶段驱动外源基因的表达模式,对开花后12,20,30,35,40 d的颖果进行GUS染色。结果表明,阴性对照(缺失启动子:图7-A1)无着色,在开花后12 d,GUS在胚及胚乳中均表达(图7-A2),随着籽粒的发育其在胚乳中的表达量逐渐降低,在开花后40 d,主要在胚中表达(图7-A3—B1、B2—B3)。

A1.缺失启动子(DAF 40); A2. PZm2G006585(开花后12 d,DAF 12); A3.PZm2G006585(DAF 20); B1.PZm2G006585(DAF 30); B2.PZm2G006585(DAF 35); B3.PZm2G006585(DAF 40)。A1.Promoter deletion(DAF 40); A2. PZm2G006585(12 days after flowering, DAF 12); A3.PZm2G006585(DAF 20); B1.PZm2G006585(DAF 30); B2.PZm2G006585(DAF 35); B3.PZm2G006585(DAF 40).图7 PZm2G006585在水稻籽粒中的表达模式Fig.7 Expression pattern of PZm2G006585 in rice grains

2.5 转基因拟南芥的筛选及鉴定

鉴于所克隆的PZm2G006585在水稻成熟籽粒中表现为驱动外源基因在胚中优势表达,为评估候选基因启动子序列的转录强度,选用转化效率高、周期短的拟南芥作为受体材料进行启动子转录活性的评价。

利用含有草铵膦和头孢霉素抗性的MS筛选培养基对拟南芥进行筛选,转基因与非转基因幼苗表型差异明显(图8-A)。以野生型为阴性对照,参照Phire Plant Direct PCR Kit说明书对抗性植株中的GUS进行鉴定,预期的片段大小为500 bp,部分结果见图8-B,筛选出目标条带与预期大小一致的转基因植株。根据孟德尔分离定律(Law of segregation),筛选单拷贝纯合体植株(图8-C)。

A.转基因植株的筛选;B.部分T1阳性株中GUS的 PCR鉴定(M.DNA分子质量标准;1—47.转基因拟南芥株系编号;48.阴性对照);C.T3单拷贝纯合体幼苗。A.Screening of transgenic plants;B.PCR identification of GUS in some T1 generation positive strains(M.DNA Marker;1—47.Serial number of transgenic Arabidopsis;48.Negative control);C.T3 generation single copy homozygotic seedlings.图8 单拷贝纯合体拟南芥的筛选Fig.8 Screening of single copy homozygous Arabidopsis

2.6 PZm2G006585驱动GUS在转基因拟南芥成熟种子中表达的活性分析

为了比较不同启动子驱动外源基因转录活性的差异,除采用前述的对照启动子外,增加了菜豆球蛋白基因来源的种子特异性启动子PPvphas作为双子叶植物种子特异性启动子对照。各启动子单拷贝拟南芥株系种子的GUS活性检测结果如图9所示,PZm2G006585、POsGluB-4、Pubi、PPvphas、PZmLeg1、PZmZein27、缺失启动子(ΔP)、野生型对照(WT)植株种子的GUS活性平均分别为909.52,5.60,628.73,5 753.20,10.45,15 588.91,5.85,3.76 nmol/(min·mg)。

不同字母代表0.05水平的差异显著性。Different letters represent significant difference at the 0.05 level.图9 拟南芥中GUS活性分析Fig.9 GUS activity analysis in Arabidopsis

前期研究表明,玉米籽粒特异性启动子PZm2G006585可驱动外源基因在胚中优势表达,故虽然转基因拟南芥的胚乳组织在种子成熟过程会被消耗,但其胚组织中GUS的表达量仍然可以作为评价启动子转录活性的依据。所克隆的PZm2G006585,其转录活性与组成型启动子Pubi差异不显著。

3 结论与讨论

PLATZ(Plant AT-rich sequence and zinc-binding protein)是一类新型的植物锌依赖性转录因子,最早发现于豌豆(Pisumsativum),命名为PLATZ1,可非特异性结合于富含A/T序列元件(A/T rich motif)而抑制转录[25]。本研究基于玉米表达谱芯片数据筛选出在籽粒中优势表达基因GRMZM2G006585,Li等[26]的研究发现,GRMZM2G006585的产物floury3为PLATZ类转录因子,在玉米发育中的胚乳和胚中表达,而在根、茎、叶等器官不表达。本研究对PZm2G006585驱动GUS在转基因水稻籽粒中表达模式的观察结果与其一致。

强转录活性的种子特异性启动子可驱动目标基因在受体植物种子中特异性高水平转录,是种子生物反应器研究领域重要的目标基因转录调控元件。Russell等[17]克隆γ-玉米醇溶蛋白基因编码区上游1.1 kb启动子序列(PZmZein27)。研究发现,该启动子在胚乳组织中优势表达[17,27]。Boothe等[28]研究发现,在受体植物拟南芥中β-菜豆蛋白基因启动子PPvphas是参比的6 个种子特异性启动子中转录活性最强的。该启动子的顺式作用元件研究较为深入且已成功应用于驱动胰岛素在拟南芥种子中特异性高水平表达[23,29]。通过转基因水稻的GUS组织化学染色试验发现,所发掘的PZm2G006585在受体植株的胚中优势表达。为了准确评估该启动子在胚中的转录活性,以GUS为报告基因,以PZmZein27、PPvphas等为对照,构建了包括PZm2G006585在内的多个表达载体;基于快速获取可供统计分析的单拷贝转基因株系的目的,开展了拟南芥的转化、筛选和外源基因拷贝数检测等系列工作。在分析各启动子转基因拟南芥T3单拷贝株系种子中GUS活性时,发现一个有趣的现象:玉米来源的PZmZein27转基因株系的平均酶活性为15 588.91 nmol/(min·mg),显著高于PPvphas(5 753.20 nmol/(min·mg))。该结果为双子叶植物种子生物反应器提供了新的候选启动子资源。

胚特异性启动子在以玉米籽粒为生物反应器的生物技术应用中发挥着重要作用,然而,有限的玉米胚特异性启动子限制了玉米生物反应器技术的发展应用,且启动子强度较高、组织特异性强的Glb1和Glb2[30]均已被专利化,限制了我国生物技术育种产业的发展。柳小庆[31]对胚特异性启动子进行研究,基于玉米芯片数据,发掘了一批玉米胚特异性强的启动子,首次揭示了玉米、高粱、大豆中存在双向基因对,并鉴定了玉米中的双向启动子。本研究也基于玉米芯片数据对玉米来源的籽粒特异性启动子进行研究,发现PZm2G006585驱动外源基因仅在水稻的籽粒中表达,在各营养器官及花中均不表达,可定义为籽粒特异性启动子;就籽粒染色情况而言,其可驱动外源基因在胚中优势表达。转基因拟南芥单拷贝株系T3种子中GUS活性检测结果表明,PZm2G006585驱动的GUS活性为909.52 nmol/(min·mg),进一步证明其可驱动外源蛋白基因在受体植物种子中表达。

综上,本研究利用玉米表达谱芯片数据发掘出籽粒特异性表达基因GRMZM2G006585,克隆其启动子PZm2G006585,构建了植物表达载体,通过对转基因材料中GUS的组织化学染色和荧光化学检测,认为PZm2G006585为籽粒特异性启动子,且主要驱动GUS在胚中优势表达。