范鑫宇,任晓蕾,霍金海,孙国东,王伟明

(黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036)

满山红为杜鹃花科杜鹃花属植物兴安杜鹃RhododendrondauricumL.的干燥叶,收录于历版《中华人民共和国药典》,具有祛痰、止咳的功效,常用于治疗急慢性支气管炎,主要分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古等省区[1-2]。满山红主要含有黄酮类、挥发油类化合物,经研究发现还具有镇痛、抗氧化、抗癌等功效[3]。满山红含有黄酮类的成分较多,是治疗咳嗽、哮喘、痰多的主要活性成分,如杜鹃素、去甲杜鹃素、槲皮素等[4-5];此外还有文献报道满山红还含有少量机酸类、萜类等成分[6-7];但目前关于满山红复杂化学成分的整体分析方法尚未见报道。UPLC-Q-TOF/MS技术通过查阅文献构建杜鹃属植物一级质谱数据库包括相对分子质量、名称结构式等[8]可快速鉴定天然药物中的化学成分,具有高分辨率、高灵敏度、专属性强等优点,常用于中药材中的化学成分鉴定[9-10]。因此,本实验使用液质联用技术分析满山红中的化学成分。

1 实验材料

1.1 药材 满山红于2021年9月采自黑龙江省大兴安岭,经黑龙江省中医药科学院霍金海研究员鉴定为杜鹃花科杜鹃花属植物兴安杜鹃RhododendrondauricumL.的干燥叶,放置于通风处阴干7 d,粉碎成细粉用于样品制备。

1.2 仪器与试剂 Tripe-TOF 5600+型的质谱仪:美国AB SCEIX公司;ExionLCTM的液相色谱仪:美国AB SCEIX公司;XSR205DU型精密分析天平、ML104T型电子天平:上海梅特勒-托利多仪器有限公司;Analyst TF 1.6 software软件、Peakview 2.0/masterview1.0 software软件:美国AB SCEIX公司。试剂:甲酸乙腈为色谱纯;甲醇为分析纯;水为蒸馏水。

2 方法

2.1 供试品溶液制备 取本品细粉2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25 mL,称定重量,超声处理(功率250 W,频率33 kHz)30 min,放冷,再称定重量,甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.2 色谱条件 色谱柱Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);柱温保持35 ℃;0.1%甲酸-水(流动相A)-0.1%甲酸-乙腈(流动相B);洗脱程序为0～4 min,5%～70%B;4～23 min,70%～100%B;23～23.10 min,100%～5%B;23.10～25.00 min,5%～5%B;设置流速为0.3 mL/min;进样量3 μL。

2.3 质谱条件 正负离子模式下的电喷雾离子源;离子源电压5 500 V、温度550 ℃;雾化气:辅助气:气帘气为55 psi;55 psi;35 psi;Product Ion扫描范围为50～1 500 Da。

2.4 数据分析 吸取供试品溶液,按照2.2、2.3 项下条件进行数据采集,用于数据分析。

2.4.1 目标性筛查 查阅文献构建杜鹃属植物一级质谱数据库包括相对分子质量、名称结构式等,使用peakview2.0软件设置质量数偏差小10 ppm,根据精确相对分子质量、碎片离子峰等信息,对组分样本进行筛查。使用Natural products HR-MS/MS Spectral Library 1.0 software筛查,将化合物的二级质谱信息与数据库中对照品的二级谱图信息进行比对。

2.4.2 非目标性筛查 将采集数据导入Marker View软件,选择母离子强度>3000 counts,S∶N>10 的所有色谱峰,依据相对分子质量,推测可能化学成分组成,再根据碎片离子峰以及文献报道的裂解规律等信息,推断化合物结构。

3 结果

3.1 UPLC-Q-TOF/MS分析 中药化学成分繁多复杂,采用单一模式不能整体研究其组成,故本实验按照色谱、质谱条件对供试品溶液在正、负离子模式下进行测定,总离子流图见图1。

图1 满山红总离子流图(A.正离子;B.负离子)

3.2 结构鉴定 通过UPLC-Q-TOF/MS技术分析与鉴定,推断满山红中60个化合物,包括25个黄酮类化合物、5个香豆素类化合物、7个有机酸类化合物、4个三萜类化合物、3个二萜类化合物、16个其他化合物,结果见表1。

表1 满山红结构鉴定结果

3.3 化合物的质谱裂解特征分析

3.3.1 黄酮类化合物的分析鉴定 黄酮类化合物是很多中药材都含有的化学成分,他的质谱裂解规律也在大量文献中报道[11-13],实验共分析鉴定了25种黄酮类化合物,以36号化合物为例,ESI+模式下准分子离子的质荷比为m/z301[M+H]+,经碰撞产生碎片离子m/z147[M+H-C8H8O-2OH]+,又经碰撞产生碎片离子m/z107[M+H-C8H8O-C2H2O3]+,C环发生RDA裂解产生二级碎片离子m/z181[M+H-C8H8O]+和m/z119[M+H-C9H10O4]+,根据数据库推断化合物36为杜鹃素,该化合物的二级质谱图与标准品比对镜像图见图2,可能的裂解方式见图3。

图2 杜鹃素二级质谱图

图3 杜鹃素可能的裂解图

3.3.2 香豆素类化合物的分析鉴定 研究表明香豆素类是满山红主要含有的一类化合物[14-15],本实验中共分析鉴定出5种香豆素类化合物,以50号化合物为例,ESI-模式下准分子离子的质荷比为m/z161[M-H]-,失去一分子CO2,产生碎片离子m/z117[M-H-CO2]-,失去一分子CO产生二级碎片离子m/z133[M-H-CO]-,经碰撞,生成碎片离子m/z105[M-H-2CO]-。推断其为7-羟基香豆素,该化合物的二级质谱图与标准品比对镜像图见图4,可能的裂解方式见图5。

图4 7-羟基香豆素二级质谱图

图5 7-羟基香豆素可能的裂解图

3.3.3 有机酸类化合物的分析鉴定 有机酸类成分在中草药的根、叶中广泛分布,但满山红中有机酸类成分目前报道较少[16-17],本实验分析鉴定了7 种有机酸类化合物,以1号化合物为例,ESI-模式下准分子离子的质荷比为m/z191[M-H]-,脱去一分子H2O产生二级碎片离子m/z173[M-H-H2O]-,又脱去一个CH2O2产生碎片离子m/z127[M+H-H2O-CH2O2]-,脱去一分子H2O生成二级碎片离子,m/z109[M+H-2H2O-CH2O2]-。推断化合物1为奎宁酸,该化合物的二级质谱图与标准品比对镜像图见图6,可能的裂解方式见图7。

图6 奎宁酸二级质谱图

图7 奎宁酸可能的裂解图

4 讨论

UPLC-Q-TOF/MS技术可以对中药材的化学成分进行系统定性分析,全面阐明其化学物质基础,丰富药材的化学成分信息[18],本实验为满山红质量的评价以及含满山红的复方制剂研究奠定了基础。

文献报道黄酮类化合物是治疗急慢性支气管炎的关键性成分[19-20],从实验鉴定结果来看,满山红含有大量黄酮类成分;还含有杜鹃属类少量的有毒性木藜芦烷二萜类化合物,如木藜芦毒素Ⅶ、帚天人菊素B。并在满山红中首次发现原莪述烯醇、去甲丁香色原酮等成分。本实验为杜鹃属植物化学成分质谱规律分析提供借鉴,对满山红资源的进一步开发与利用具有指导意义。