许 鑫，刘 蕊，孔令兰，王艳梅

（山东鲁抗医药股份有限公司，山东 济宁 272100）

β-内酰胺抗生素抗菌效力好，毒副作用低，应用广泛。氨苄西林是β-内酰胺类的一类代表性药物，主要用于治疗细菌感染，如中耳炎、鼻窦炎及急性细菌性膀胱炎等。D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐是一类重要的医药起始物料及中间体，是酶法生产氨苄西林、头孢氨苄、头孢克洛等β-内酰胺类抗生素药物不可或缺的活性侧链[1]。D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐的手性异构体参与反应，易造成后续氨苄西林中手性杂质的生成。目前对其手性异构体的拆分研究鲜有报道，本文参考相关文献[2-8]，建立手性固定相高效液相色谱（HPLC）测定D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐中手性异构体L-苯甘氨酸甲酯盐酸盐含量的方法。该方法操作简便，专属性强，灵敏度高，适用于D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐手性杂质的控制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；MSA6.6S-OCE-DM电子天平（德国Sartorius）；XSR205DU/A型电子天平（Mettler Toledo）。

1.2 药品与试剂

D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐样品（河北泽硕药业科技有限公司，批号：2104003，2104004，2104005）；L-苯甘氨酸甲酯盐酸盐对照品（河源广谱生物科技有限公司，批号：G31210128-01，含量：97.75 %）；正己烷（色谱级，天津赛福瑞科技有限公司）；二乙胺（色谱级，天津市大茂化学试剂厂）；异丙醇（色谱级，美国Fisher）；无水乙醇（色谱级，天津科密欧化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：CHIRALPAK IA（250 mm×4.6 mm，5 μ m）；流动相：正己烷:异丙醇:二乙胺（920:80:1）；柱温30 ℃；流速0.8 ml/min；进样体积：20 μl。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 取L-苯甘氨酸甲酯盐酸盐对照品约5 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照品储备溶液。精密吸取对照品储备溶液1 ml，置20 ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 混合溶液（加标供试品溶液） 取D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐约50 mg，精密称定，置20 ml量瓶中，精密吸取L-苯甘氨酸甲酯盐酸盐对照品储备溶液1 ml，置同一20 ml量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液 取D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐约50 mg，精密称定，置20 ml量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得。

2.3 测定方法

分别精密吸取2.2项下混合溶液、对照品溶液、供试品溶液各20 μl，进样检测，混合溶液中L-苯甘氨酸甲酯盐酸盐与D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐的分离度应不得低于1.5，供试品溶液色谱图中如有L-苯甘氨酸甲酯峰，按外标法计算其含量。

2.4 分析条件的优化

通过对检测波长、流动相比例、色谱柱等进行优化，确定了最佳色谱条件。

2.4.1 检测波长的选择 通过仪器全波长扫描，D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐样品在230 nm有较强吸收，因此选择230 nm作为检测波长。

2.4.2 流动相选择 在方法摸索过程中，以正己烷:异丙醇=90:10、正己烷:异丙醇=95:5、正己烷:异丙醇=92:8为流动相，均无法将L-苯甘氨酸甲酯盐酸盐与D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐拆分；结合正己烷与异丙醇不同比例组合中L-苯甘氨酸甲酯盐酸盐与D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐保留时间的试验结果，最终选择以正己烷:异丙醇=92:8为流动相，在流动相中加入二乙胺，含量为0.1 %，L-苯甘氨酸甲酯盐酸盐与D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐在该流动相中得到了很好的分离。

2.4.3 色谱柱选择 在方法摸索过程中，对比了L-苯甘氨酸甲酯盐酸盐与D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐在CHIRALPAK AD-H、CHIRALPAK IA与CHIRALPAK IC色谱柱中的分离情况及峰形。结果表明，L-苯甘氨酸甲酯盐酸盐与D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐在CHIRALPAK AD-H色谱柱中无法分离，在CHIRALPAK IC色谱柱中未能完全分离且峰严重拖尾，峰型较差；但在CHIRALPAK IA色谱柱中两者分离度符合规定，峰形良好。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性 取空白溶剂（无水乙醇）、对照品溶液、混合溶液各20 μl，进样分析。结果表明，空白溶剂（无水乙醇）对L-苯甘氨酸甲酯盐酸盐检测无干扰；混合溶液中，L-苯甘氨酸甲酯盐酸盐与D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐的分离度＞1.5，符合规定。专属性叠加图见图1。

图1 专属性叠加图

2.5.2 检测限与定量限 将2.2.1项下L-苯甘氨酸甲酯盐酸盐对照品溶液以无水乙醇为溶剂进行稀释，测出的信号与空白处的信号（基线噪音）进行比较。对照品溶液浓度稀释为1.3 μg/ml时，L-苯甘氨酸甲酯盐酸盐与空白溶剂信噪比（S/N）略大于10，此浓度即为定量限；对照品溶液浓度稀释为0.6 μg/ml时，S/N略大于3，此浓度即为检测限。

2.5.3 线性 分别精密吸取对照品储备溶液，加无水乙醇稀释制成1.3～37.6 μg/ml溶液，按2.1项下色谱条件分别进样检测，记录色谱图。以浓度（x）对峰面积（y）作线性回归，回归方程为：y=0.119x-0.046，相关系数（r）为0.998。

2.5.4 重复性与中间精密度 两位分析员，在不同日期，分别配置制加标供试品溶液6份，采用不同仪器，按2.1项下色谱条件进样检测，记录色谱图。结果，两位分析员分别配置的6份加标供试品溶液测定重复性RSD分别为2.4 %和4.1 %，不同分析员12次测定中间精密度的RSD为4.4 %，均小于5 %。

2.5.5 准确度 取L-苯甘氨酸甲酯盐酸盐对照品约5 mg，加无水乙醇溶解并定量稀释制成约0.5 mg/ml的溶液作为杂质对照品储备液。分别取D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐约50 mg，精密称定，分置于9个20 ml量瓶中，分成3组，分别加入对照品储备溶液0.8，1.0，1.2 ml，加无水乙醇稀释定容刻度，制成80 %，100 %，120 % 3个浓度的准确度试验溶液。分别精密量取上述溶液各20 μl，进样测定，计算回收率，平均回收率为104.3 %，RSD＜10.0 %。结果见表1。

表1 加样回收试验结果

2.5.6 耐用性 分别改变流速±0.1 ml/min、流动相中异丙醇比例±5 %、二乙胺添加量±20 %，评价流速、流动相配比、二乙胺添加量改变后对检测的影响。结果表明，色谱条件略有变动时，检测结果与原条件检测结果的相对偏差（RD）均小于5 %，符合规定，表明方法耐用性良好。

2.6 样品测定 取D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐样品，对其L-苯甘氨酸甲酯盐酸盐含量进行测定，结果见表2。3批样品中L-苯甘氨酸甲酯盐酸盐含量均低于0.05 %。

表2 D-苯甘氨酸甲酯盐酸供试品中L-苯甘氨酸甲酯盐酸含量检测结果

3 讨论

本文尝试以不同比例的正己烷与异丙醇组合为流动相，均不能将L-苯甘氨酸甲酯盐酸盐与D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐拆分。向正己烷:异丙醇（92:8）混合液中添加0.1 %二乙胺后，两者分离良好。同时也对色谱柱进行了筛选，选用CHIRALPAK IA（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱时，L-苯甘氨酸甲酯盐酸盐与D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐不仅分离度符合规定，且峰形良好。该方法专属性强，准确度良好，可为D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐中手性异构体的检测提供重要依据。