马向霞，马志平，侯美羽，苏艳华

(天津市医药集团技术发展有限公司，天津 300193)

马向霞，马志平，侯美羽，苏艳华

(天津市医药集团技术发展有限公司，天津 300193)

目的：建立用HPLC法测定4-硝基苯丙胺盐酸盐中有关物质2-硝基苯丙胺盐酸盐的方法。方法：采用C18色谱柱，以0.020 mol/L磷酸二氢铵(2%三乙胺，磷酸调pH 4.5)-乙腈(95∶5)为流动相，流速为1.0 ml/min，检测波长为220 nm，柱温为30 ℃。结果：2-硝基苯丙胺盐酸盐与相邻杂质峰及主成分分离良好，2-硝基苯丙胺盐酸盐在0.496～11.904 μg/ml浓度范围内与峰面积线性关系良好(r=0.999 8)，定量限为5.0 ng，检测限为2.5 ng，平均回收率(n=9)为98.3%，RSD为3.5%；结论：该方法适用于4-硝基苯丙胺盐酸盐中2-硝基苯丙胺盐酸盐的测定，方法简便，结果准确。

4-硝基苯丙胺，2-硝基苯丙胺，有关物质，高效液相色谱法

随着药品研发要求不断提高，起始原料中有关物质控制是质量控制的重中之重。4-硝基苯丙胺盐酸盐在合成过程中可能引入的主要有关物质为2-硝基苯丙胺盐酸盐，其为4-硝基苯丙胺盐酸盐的同分异构体，会直接参与后续反应，含量过高，后续步骤又不能有效去除，则可能导致成品原料药质量不合格，所以控制4-硝基苯丙胺盐酸盐中2-硝基苯丙胺盐酸盐的含量就极为重要。

样品中异构体含量可采用气相色谱法进行检测[1,2]。选择合适的流动相条件，样品中同分异构体含量也可采用高效液相色谱法进行检测[3]。本法建立了4-硝基苯丙胺盐酸盐中有关物质2-硝基苯丙胺盐酸盐检测的高效液相色谱法，操作简便，灵敏度高，重复性好，专属性强。参照《中国药典》[4]进行了方法学验证。该方法适用于4-硝基苯丙胺盐酸盐中的有关物质2-硝基苯丙胺盐酸盐含量测定。用本方法对3个批次4-硝基苯丙胺盐酸盐中2-硝基苯丙胺盐酸盐进行检测，结果表明3批4-硝基苯丙胺盐酸盐样品中2-硝基苯丙胺盐酸盐含量均小于1.0%。

1 仪器与试药

日本岛津LC-20AT型高效液相色谱仪(SPD-20A紫外检测器，岛津LC-Solution色谱工作站，日本岛津公司)；天平(赛多利斯BT25S和赛多利斯BS110S)。4-硝基苯丙胺盐酸盐(苏州爱玛特生物科技有限公司，批号131007，纯度99.70%)；2-硝基苯丙胺盐酸盐(天津市医药集团技术发展有限公司，批号140505，纯度97.9%)；三乙胺为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；乙腈为色谱纯(天津市康科德科技有限公司)；娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.020 mol/L磷酸二氢铵(2%三乙胺，磷酸调pH 4.5)-乙腈(95∶5)；流速：1.0 ml/min；检测波长：220 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。在上述色谱条件下，4-硝基苯丙胺盐酸盐和2-硝基苯丙胺盐酸盐理论塔板数分别为8 838和7 613，均大于5 000，符合要求。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取适量2-硝基苯丙胺盐酸盐，用流动相溶解并稀释制成每1 ml含20 μg的溶液，作为对照品贮备液，精密量取5 ml，置10 ml量瓶中，流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液制备 精密称取适量4-硝基苯丙胺盐酸盐，用流动相溶解并稀释制成每1 ml含1 mg 4-硝基苯丙胺盐酸盐的溶液，摇匀，即得。

2.2.3 阴性对照溶液制备 精密称取4-硝基苯丙胺盐酸盐对照品适量，用流动相溶解并稀释制成每1 ml含1 mg 4-硝基苯丙胺盐酸盐的溶液，摇匀，即得。

2.3 系统适用性考查 精密称取适量4-硝基苯丙胺盐酸盐，用流动相溶解并稀释制成每1 ml含1 mg 4-硝基苯丙胺盐酸盐的溶液，注入液相色谱仪，考查2-硝基苯丙胺与相邻杂质间的分离度。结果2-硝基苯丙胺盐酸盐与相邻杂质最小分离度为2.1，4-硝基苯丙胺盐酸盐和2-硝基苯丙胺盐酸盐的分离度为12.4，分离度均符合要求。见图1。

2.4 线性关系考查 精密量取适量“2.2.1”项下的对照品贮备液，用流动相作为溶剂进行不同比例稀释，制成各级线性对照品溶液，分别精密量取10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度为横坐标(C)，峰面积为纵坐标(A)进行线性回归。回归方程为：A=13 987C-60.5(r=0.999 8)。结果表明，2-硝基苯丙胺盐酸盐在0.496～11.904 μg/ml范围内，线性关系良好。

1. 2-硝基苯丙胺盐酸盐 2. 4-硝基苯丙胺盐酸盐

2.5 重复性试验 按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法平行制备6份，按照“2.1”项下的色谱条件分别进样，外标法以峰面积计算样品中2-硝基苯丙胺盐酸盐的含量，可得出6份供试品溶液中2-硝基苯丙胺盐酸盐平均含量为0.20%，RSD为3.80%，结果表明方法重复性良好。

2.6 稳定性试验 取供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件分别于室温下0、2、4、8、12和24 h进样，记录色谱图，考查供试品溶液中2-硝基苯丙胺盐酸盐含量，24 h内2-硝基苯丙胺盐酸盐含量在0.19%～0.21%之间，结果表明供试品溶液室温下放置24 h内稳定。

2.7 定量限与检测限的测定 将对照品溶液稀释后进样，以信噪比10∶1时的进样量(ng)为定量限，信噪比3∶1时的进样量(ng)为检测限，测得2-硝基苯丙胺盐酸盐的定量限为5.0 ng，检测限为2.5 ng。

2.8 回收率试验 精密称取约10 mg 4-硝基苯丙胺盐酸盐，置10ml量瓶中，称取9份，分别用“2.2.1”项下对照品贮备液4、5和6 ml各3份，分别置于上述9个10 ml量瓶中，流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得回收率试验溶液。以“2.5”项下重复性实验的数据作为加样前回收率试验溶液。按“2.1”项下的色谱条件进样测定，扣除本底后计算2-硝基苯丙胺盐酸盐的回收率为98.3%，RSD为3.5%，见表1。

表1 回收率试验结果

2.9 样品测定 取3批4-硝基苯丙胺盐酸盐，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依“2.1”项下色谱条件进样测定，外标法以峰面积计算样品中2-硝基苯丙胺盐酸盐的含量，结果见表2。

表2 样品测定结果

3 讨论

3.1 流动相的选择 经比较，流动相pH大于5.0时，4-硝基苯丙胺盐酸盐拖尾因子较大，乙腈比例较大时，不能将4-硝基苯丙胺盐酸盐与2-硝基苯丙胺盐酸盐分开。加入2%三乙胺能大大改善4-硝基苯丙胺盐酸盐的对称因子，且所选用的流动相能使2-硝基苯丙胺盐酸盐与4-硝基苯丙胺盐酸盐的分离度达到12.4，最终确定流动相为0.020 mol/L磷酸二氢铵(2%三乙胺，磷酸调pH 4.5)-乙腈(95∶5)。

3.2 批次间杂质含量的差异 企业不同批次4-硝基苯丙胺盐酸盐之间2-硝基苯丙胺盐酸盐含量差异较大，考虑到起始原料的质量直接影响药品中原料药的质量，故原料药生产企业在将4-硝基苯丙胺盐酸盐作为起始原料时应考查不同2-硝基苯丙胺盐酸盐含量对后续中间体及成品的影响，从而获得满意的原料药产品。本方法的建立为以4-硝基苯丙胺盐酸盐为起始原料的原料药企业购买合格的起始原料提供了良好的检测方法，同时为4-硝基苯丙胺盐酸盐生产企业控制产品中2-硝基苯丙胺盐酸盐含量提供了准确的检测方法。

1 王世玉，刘菲，刘玉龙. 气相色谱-质谱法检测地下水中12种壬基酚同分异构体[J]. 分析化学，2013，41(11)：1699-1703

2 林麒，李国波，葛品. 气相色谱-质谱联用法检测母乳脂肪中反式脂肪酸[J]. 色谱，2016，34(5)：520-527

3 韩明友，申卫华，时军. 反相高效液相色谱法分离和测定硝基苯酚的三种异构体[J]. 分子科学学报，1997，13(4)：247-250

4 中国药典[S]. 四部.2015：374-377

2016-07-12

R927.2

A

1006-5687(2016)05-0026-03