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性别控制技术研究进展

2023-04-05文成龙马雪瑶胡张涛刘伟东胡建宏

家畜生态学报 2023年1期
关键词:分离法雄性睾丸

文成龙,马雪瑶,杨 瑞,胡张涛,刘伟东,胡建宏

(西北农林科技大学 动物科技学院,陕西 杨陵 712100)

性别控制技术被称为家畜繁育改良的第三次革命,是指通过对动物正常生殖过程进行人为干预,使家畜产生的后代性别符合人们需要的一种繁殖技术[1]。通过性别控制技术可以使与性别有关的经济性状所产生的经济效益更大,如泌乳量、生长速度以及肉质等;此外,运用性别控制技术还能提高选种强度、增加育种效率,以及克服伴性有害基因的危害[2]等,因此,研究性别控制技术对家畜的繁育改良十分重要。本文以性别控制技术为切入点,对性别分化的基因调控、性别反转、X和Y精子分离的方法如电泳法、精子上游分离法、白蛋白柱分离法、免疫分离法和流式细胞仪分离法进行综述,以期为与性别控制相关的研究提供参考。

1 性别分化的基因调控

性别分化是从性腺的形成和发育开始的,原始生殖细胞(Primordial Germ Cells,PGCs)经过迁移与体细胞结合形成完整的胚胎性腺[3],随后胚胎性腺会在多种信号因子的作用下向着睾丸或者卵巢分化,这些信号因子的产生需要激活特异性睾丸或卵巢信号通路,而任一通路的激活就会对另一特异性通路产生抑制。

1.1 睾丸的分化调控

SRY基因是Y染色体中对性别分化起决定性作用的基因,其在雄性动物睾丸发育过程中能激活SOX9,并与其共同作用于WT1、NR5A1、GATA4等基因,最终导致睾丸的形成和雄性性别分化[4]。

睾丸发育开始时,EMX2和LHX9开始表达,LHX9和WT1可以激活NR5A1表达,而NR5A1和WT1可以激活AMH表达,其表达可诱导缪勒氏管退化,刺激雄性器官的发育[5],同时CBX2不仅促进性腺的形成,而且也促进SRY、WT1、NR5A1的转录[6]。睾丸开始发育期间,SOX9通过睾丸增强子核心序列 TESCO调节自身转录,或者与 FGF9、PTGDS形成彼此促进表达的正向调控循环,SOX9的高水平表达状态可以代替SRY的调节功能,进一步诱导睾丸的发育[7]。研究表明在睾丸分化的成熟阶段,DMRT1维持了睾丸的后期发育,DMRT1可以抑制与卵巢发育有关的基因FOXL2的表达,一直到机体的成熟[8]。

1.2 卵巢的分化调控

卵巢的发育是以抑制雄性睾丸发育特异基因的表达为基础的,通过WNT4基因的表达来调控卵巢的发育[9]。卵巢发育初步开始时,WNT4与RSPO1 共同促进 CTNNB1的表达,激活FOXL2基因抑制SOX9的表达,促进了卵巢的发育[10]。WNT4 、RSPO1、CTNNB1和FOXL2的表达能够调节FST等基因的表达转录,从而促使卵巢发育的开始[11]。研究发现,FOXL2基因有维持卵巢和卵泡发育的作用,其通过抑制WT1的表达来阻止卵泡发育过程中NR5A1和SOX9的表达。在卵巢发育成熟阶段,FOXL2与RUNX1相互促进,降低DMRT1表达,维持促进卵巢的发育[12]。

2 性别反转的调控

性别反转是指由于某些原因,个体从一种性别特征转换成为另一种特征的现象,表现为个体表型与性染色体不同,即只是生殖腺及其表型发生变化而其性染色体并没有发生变化。因此可将性别反转分为XX性别反转(染色体型为XX,表型为雄性)和XY性别反转(染色体型为XY,表型为雌性)。在部分较低等动物尤其是在水生生物中,由于外界环境的改变会使其发生性别反转,但仍然拥有正常的繁殖能力。而哺乳动物由于性腺比较稳定,至今尚未发现具有繁殖能力的自然性反转现象,但高等动物能通过基因和激素调控的方式人为实现反转,这是通过性别分化的机制启动性别反转调控的一种方式[13]。

早在1991年,就有研究者通过将存在SRY的Y染色体片段导入雌鼠胚胎的手段,使部分雌鼠发育为雄性,证明了性别反转在动物性别控制应用的可行性[14]。由于Sp1结合位点在人类和兔子中具有高度的同源性,因此,兔子是一个用来确定临床雄性对雌性的性别逆转综合征的合适的动物模型。研究者应用CRISPR/Cas9质粒显微注射到原核期受精卵的细胞质中,通过破坏兔SRY基因5'侧翼区的Sp1-B和Sp1-C结合位点导致雄性动物性反转为雌性[15]。随后将囊胚期胚胎移植后得到12只性反转兔,暗示具有雌性表型的SRY基因敲除的雄性兔子可能维持怀孕并产下活的幼崽[15]。在猪上,具有SRY基因敲除的基因雄性猪会经历外部和内部生殖器的性别逆转。SRY作为猪性别决定的主要开关的发现,可能为猪生产中防止公猪感染的外科阉割提供一种替代方法[16]。猪与人类在遗传、生理和解剖上有很多的相似性,也为人类性逆转综合征提供了一个合适的大型动物模型,从而可以开发新的人类性障碍干预措施。从最早在鼠上实现性别反转到在猪上实现性别反转,表明了性别反转的可行性,有望在更多的动物上实现性别反转。

3 X、Y精子分离方法

分离X、Y精子的方法主要是利用其物理、化学和生物差异进行,如精子的大小、密度、电荷、DNA含量等。随着研究的不断深入,X、Y精子分离技术得到发展和完善。目前,能应用的分离技术包括电泳法、免疫学分离法、流式细胞仪分离法等。

3.1 电泳法

由于不同精子表面膜电位带电荷数的差异,使不同精子在电场内向不同电极游动,从而达到分离精子的效果。孙玲等[17]用电泳法成功的分离了人类的精子。利用电泳法分离出的正常精子形态比率、DNA未损伤比例和受精能力均优于梯度离心法,但电泳法处理的精子活率并不理想,而且此方法的分离结果容易受到环境和pH的影响,所以此方法在生产中并不常用[18]。

3.2 精子上游分离法(Swim-up)

X精子和Y精子在TALP溶液中的活力高低不同,Y精子有更快的运动速度且可穿透TALP溶液聚集在上层,从而分离X、Y精子。Yan等[19]用此方法分离了牛精子,但是其体外授精后的胚胎性别比例并没有明显的变化,分离效果并不显著。然而Azizeddin等[20]通过改进后的swim-up法分离出了大量具有受精能力的精子。这种方法操作简单而且费用较低,可以用于生产实践。Umehara等[21]研究表明,TLR7/8的配体激活选择性地抑制了携带X染色体的精子(X精子)的运动,但不影响精子的活率,而未受抑制的Y精子则向上游动,精子活力的不同使得Y精子和X精子得以分离,将上层精子进行体外受精后,雄性胚胎占90%,胚胎移植后获得的后代中有83%是雄性,相反,用下层精子产生的胚胎和后代中有81%是雌性。

3.3 白蛋白柱分离法

当X、Y精子在白蛋白溶液中运动时,Y精子具有更快的速度,故可以用白蛋白柱来分离精子。但是分离的结果并不理想,Beernink等[22]用白蛋白柱分离出牛的Y精子然后进行授精,其后代的性别比例并没有明显的变化。

3.4 免疫分离法

免疫学分离法根据H-Y抗体可与Y精子上的H-Y抗原特异结合,以此来分离X、Y精子。罗承浩等[23]运用这一原理对奶牛进行试验,结果表明奶牛的产母犊率可达60.7%,相比于自然情况下性别比例提高了10.7%。但是此方法操作时间较长,对精子的损伤较大,影响精子活力,降低了分离精子的受胎率,故难以大规模推广。

3.5 流式细胞仪分离法

目前分离X、Y精子的最有效分离方法是利用流式细胞仪进行分离。利用X精子和Y精子中DNA含量的微小差异,可达到分离的效果[24]。利用此方法分离出的性控精液在性别控制上准确度可达到90%,并且该技术在牛的生产上已经得到了广泛的应用[25]。熊显荣等[26]利用流式细胞仪分离了牦牛精子,其分离后的精子纯度可达到94%以上,分选后的精子活力可达到54%。分离后的X精子和Y精子进行体外授精后,各组胚胎性别鉴定结果精子纯度基本吻合。尽管用流式细胞仪分离精子已取得了很大进展,但是由于成本高、周期慢、技术要求高,目前仅在牛上有效应用,该技术不能被很好地推广[27]。

4 展 望

高效、准确地控制畜禽的性别一直是现代动物生产中期望突破的技术,虽然在性别控制技术的研究领域已经取得了许多突破,但在实际生产中仍存在许多困难和挑战。流式细胞术可以基于DNA的差异精确分离X、Y精子,目前在牛生产的应用中取得良好的经济价值,但在其他一些物种中的应用较少。此外,流式细胞仪分离精子速度慢、成本高,且分离出的精子受精能力低于常规精子,冷冻解冻后的活力和顶体完整率低等问题也限制了性别控制技术的产业化。每一种性别控制技术都有其优缺点。随着科学技术的发展,性别控制技术的准确度和灵敏度将大大提高。相信在不久的将来,性别控制技术将会实现商业化并大规模生产,必将给畜牧业带来更大的经济效益。

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