赵聪聪,王砀砀,王 菁,李 永,姚军虎,曹阳春

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

随着奶牛养殖集约化程度的提高，全混合日粮(TMR)的使用越来越普遍[1]，同时，由于奶牛品种的选种选育，奶牛的产奶量迅速提升。我国优质粗饲料缺乏，为了满足奶牛能量的需要，往往采用高精料日粮[2]。但是高精料日粮的使用会引起反刍动物急性或亚急性瘤胃酸中毒(SARA)，影响机体健康[3-5]，同时持续性的瘤胃酸中毒会引发反刍动物肢蹄病，减少动物使用年限[2]。在美国，大约有19%的泌乳早期奶牛和26%的泌乳中期奶牛患有SARA[6]。在德国和荷兰，约11%的泌乳早期奶牛和18%的泌乳中期奶牛患此病[7]。因此，动物的生产性能和健康似乎成为了不可调和的矛盾。

奶牛日粮中NDF水平在很大程度上影响瘤胃健康，同时，饲料的物理特性在很大程度上影响动物的咀嚼与反刍时间，进而影响瘤胃pH[8-9]。因此，为了避免SARA在高产奶牛中的发生，NRC指出，如果以玉米青贮和苜蓿青贮为粗饲料的主要来源，则奶牛日粮中中性洗涤纤维(NDF)含量不应低于25%[10]。但是有研究发现，即使NDF含量满足要求，牛也可能出现跛行现象[2]，这说明仅NDF不足以评估反刍动物的日粮品质以及动物健康。

Mertens[11]提出了物理有效中性洗涤纤维(peNDF)的概念，即因饲料长度、粒径、韧性等物理特性引起动物反刍、咀嚼等生理活动及影响瘤胃内容物两相性质的那部分NDF，其在数值上等于NDF含量与物理有效因子(pef)的乘积(pef是用来衡量不同种类粗饲料及不同长度的相对物理有效性)[12]。Li等[13]研究发现，随着日粮中peNDF与瘤胃可降解淀粉比例的降低，瘤胃pH低于5.8和5.6的时间呈线性增加，乙酸摩尔比下降，而丙酸摩尔比增加。Li等[4]的另一项试验研究发现，降低日粮中peNDF8.0含量(从20.5降低到8.4)可以提高山羊瘤胃总VFA的量，增加琥珀酸纤维杆菌和黄色瘤胃球菌的相对丰度。表明改变日粮peNDF水平可能会影响瘤胃发酵，同时影响瘤胃细菌的组成。

因此本试验在高精料日粮的背景下，通过改变TMR的搅拌时间，获得不同peNDF水平的日粮，利用高通量测序技术探究不同peNDF水平日粮对奶牛瘤胃细菌组成的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验日粮 本试验日粮组成和营养水平见表1。通过调整TMR的搅拌时间(10、18和60 min)制成3种不同peNDF8.0日粮：高(11.25%)、中(10.56%)和低(9.02%)peNDF8.0(表2)。

表1 日粮组成与营养水平(风干基础)

表2 不同搅拌时间TMR日粮粒度分布

1.1.2 试验动物及试验设计 选取12头、2胎次的荷斯坦奶牛(产奶量为33.0±1.7 kg/d、泌乳天数131±8 d)随机分为3组，分别饲喂高(11.25%)、中(10.56%)和低(9.02%)水平的peNDF8.0日粮。试验期为25 d，其中预试期21 d，正试期4 d。每天于8:00和15:00饲喂两次，自由饮水。

1.1.3 样品采集 在试验第22-24天连续3 d采集TMR样品，使用宾夕法尼亚筛(PSPS)进行pef测定[14-15]。将3天的样品等比例混样后进行化学成分分析。试验期最后一天晨饲前通过瘤胃穿刺法采集瘤胃液进行细菌多样性测序。

1.2 方法

1.2.1 总DNA提取 使用QIAamp DNA Stool试剂盒进行DNA提取，并用NanoDrop2000进行DNA浓度和纯度检测。

1.2.2 细菌16S rRNA的高通量测序 使用正向引物：5'-AYTGGGYDTAAAGNG-3'和反向引物：5'-TACNVGGGTATCTAATCC-3'对细菌V4区进行PCR扩增。扩增体系为25 μL，包括2 μL的DNA模板，每种引物1 μL(10uM)，2 μL的dNTP(2.5 mM)，5 μL 5×Q5缓冲液，5 μL 5×Q5 GC增强剂以及0.25 μL Q5高保真DNA聚合酶(5 U/μL)。扩增产物使用2%琼脂糖凝胶电泳检测，并使用QIAGEN凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物。扩增构建Miseq文库并采用Illumina Miseq(Illumina，USA)上机测序。

1.2.3 数据处理 运用Qimme进行序列过滤[16]，运用Mothur去除嵌合体[17]。将获得的优质序列以97%的相似度进行聚类，最长的被指定为操作分类学单位(OTU)，调用BLAST[18]的方法对序列与Greengene数据库比对[19]，获得每个OTU的分类学信息。

1.2.4 数据分析 用Excel进行数据的简单整理，采用SPSS 21.0对数据进行单因素方差分析，LSD法多重比较。P<0.05表示差异显著，0.05

2 结果与分析

2.1 基本信息统计及稀释曲线

12份瘤胃液样品共获得868 623条高质量序列，平均每个样品有72 385条序列，共计15 631个OTU。从稀释曲线来看，随着样本测序深度增加，曲线越趋于平稳，说明测序量足够(图1)。

图1 样本稀释曲线

2.2 Alpha多样性指数分析

Alpha多样性用于反映微生物群落的多样性和丰富度，本试验采用Chao1和ACE指数反映群落丰富度，Shannon和Simpson指数反映群落多样性。由表3可知，低peNDF8.0日粮组的菌群丰富度指数ACE有低于其它两组的趋势(P<0.10)，其余多样性指数在3组间无显著差异。

表3 不同peNDF8.0 水平日粮对奶牛瘤胃细菌α多样性的影响

2.3 不同分类水平的群落组成分析

在门水平上，共鉴定出了22个门 (图2)。其中拟杆菌门(Bacteroidetes，80.79%～87.37%)、厚壁菌门(Firmicutes，8.40%～10.27%)、变形菌门(Proteobacteria，2.24%～6.63%)为3组间共有优势菌门，其余菌门的相对丰度均小于1%。随着日粮peNDF8.0水平的降低，拟杆菌门相对丰度减少，而厚壁菌门和变形菌门相对丰度增加。

图2 门水平组成柱状图

由表4可知，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、S24-7在3组中相对丰度都大于1%，为共有优势菌科。此外，BS11在高peNDF8.0组和中peNDF8.0组中相对丰度高于1%，为优势菌科，且显著高于低peNDF8.0组(P<0.05)。

表4 不同peNDF8.0 水平日粮对奶牛瘤胃细菌科、属水平的影响(TOP 15)

3组间唯一共有优势菌属为普雷沃氏菌属(Prevotella)，其相对丰度高达62.9%以上，远高于其它属。中peNDF8.0组丁酸弧菌属丰度高于1%，其余各属丰度均小于1%，且各组间差异不显著。与纤维消化相关的2个属的(瘤胃球菌属Ruminococcus，纤维杆菌属Fibrobacter)相对丰度也低于1%。

3 讨 论

哺乳动物肠道中微生物组成受多种因素的影响，其中日粮的影响最为直接。Sonnenburg[20]研究发现高纤维日粮能够增加微生物菌群多样性。张红涛[21]发现，随着日粮NDF水平的升高，瘤胃细菌丰富度和多样性都显著上升。这些结果都表明日粮纤维的含量能够显著影响肠道微生物菌群，且菌群多样性随纤维含量的升高而升高。本试验日粮NDF的含量是一致的，由于搅拌时间的不同，使得日粮纤维的物理有效性发生改变。随着日粮peNDF8.0水平的降低，瘤胃细菌丰富度有下降的趋势。因此推测日粮纤维的长度对微生物组成也有调控作用，但其机制有待进一步研究。

拟杆菌门和厚壁菌门为瘤胃中绝对优势菌门，但其比例随日粮精粗比的改变而适当变化[22]。当日粮纤维含量从88.0%下降到57.5%时，厚壁菌门相对丰度大幅下降，而拟杆菌门相对丰度大幅上升[22]。杨硕[23]的试验结果表明，补饲精料的青年绒山羊瘤胃中拟杆菌门的丰度升高，厚壁菌门降低。这可能是因为厚壁菌门包含很多具有纤维降解功能的微生物[24-25]。本试验使用高精料日粮，拟杆菌门相对丰度远高于厚壁菌门，与前人研究结果一致。普雷沃氏菌属为本试验中优势菌属，这与奶牛[26-27]，绵羊[28]和肉牛[29]的研究结果一致。普雷沃菌属在泌乳奶牛瘤胃中相对丰度可高达50%[23]，可能与普雷沃氏菌在瘤胃中参与广泛的物质代谢有关。有研究表明，普雷沃氏菌属可参与淀粉的消化和利用、半纤维素和果胶的消化以及蛋白质或肽的代谢[30]。

随着日粮peNDF8.0降低，BS11科的相对丰度显著下降。有研究发现，幼龄湖羊补饲开食料后瘤胃中BS11相对丰度显著升高[31]。同时，Solden等[32]发现提高日粮半纤维素和木质素含量，可使BS11的含量大大增加。说明BS11科很可能具有纤维降解功能，且对日粮纤维含量和有效性敏感。

Zhao等[33]的研究表明，随着日粮peNDF增加，动物反刍和总咀嚼的时间呈线性增加，且瘤胃pH低于5.8的时间呈线性减少。Cao等[34]的研究也表明，增加黑麦草颗粒长度可以提高瘤胃的平均pH，降低瘤胃pH低于6.0的时间。说明日粮的物理有效性能够显著影响动物的反刍行为，进而影响唾液分泌量，从而影响瘤胃pH。而瘤胃微生物有其最适的酸碱度，pH过低时往往对纤维降解菌不利。本试验基于现代化牧场高精料日粮的背景，通过减少TMR搅拌时间，适度增加纤维的物理有效性来探究对瘤胃微生物的影响。发现3种peNDF8.0日粮处理下，仅观测到BS11科差异显著。这表明日粮纤维的物理有效性也通过某种机制会对瘤胃微生物产生影响。但由于本试验3种日粮peNDF8.0差异较小，仅对物理有效性最为敏感BS11产生影响。

4 结 论

在高精料日粮下，peNDF8.0水平从9.02%上升至11.25%使得奶牛瘤胃细菌丰富度有上升的趋势，且BS11菌科随peNDF8.0水平的上升显著提高，说明日粮的物理有效性能够对瘤胃微生物组成和丰度产生影响。造成本试验结果差异不显著的原因可能是日粮精料含量过高，且3种日粮peNDF8.0水平差异不是很大。由此推测适当下调精料比例或者增加日粮纤维的物理有效性能够改变瘤胃微生物组成，进而可能实现反刍动物的健康高产。