李青青 崔玉宝 （南京医科大学附属无锡人民医院临床研究中心，无锡 214023）

IgE 是过敏性疾病的主要效应分子，大多数过敏性疾病患者血清中IgE 抗体增加，检测患者血清中过敏原特异性IgE 是过敏原查找的重要方法［1-3］。过敏原芯片基于成熟的高通量检测技术，将过敏原分子固定于载体，通过检测抗原抗体反应检测人血清中的特异性IgE，其灵敏度优于传统的免疫学检测［4］。过敏原芯片一次检测就可测量出过敏原分子IgE 过敏反应谱，方便快捷、高通量、高灵敏度、高特异度的特点使其快速发展，成为过敏性疾病诊断和治疗的重要辅助工具。本文讲述过敏原粗提取物用于过敏性疾病诊断中的不足，重组过敏原的发展和应用促进了组分分辨诊断概念进入临床，介绍了过敏原芯片的发展和应用、过敏原芯片在过敏性疾病中的诊断和应用，并对将来的发展趋势进行了展望。

1 过敏原芯片的开发

1.1 基因重组过敏原的发展及应用 过敏原粗提取物来自天然过敏物，如尘螨、花粉、海鲜等，其中包含许多蛋白质和其他分子，只有引起机体特异性IgE 升高的物质称为过敏原，非过敏原物质可能会刺激机体产生炎症反应，却不会产生过敏反应［5］。一直以来Ⅰ型过敏反应IgE 的检测都是使用过敏原粗提取物，该检测方法可判断过敏原来源，但无法确定具体是哪个过敏原分子［6］。

为减少过敏原提取物成分和质量的变化，使产品达到安全、精准和有效的较高水平，欧洲研究者提出了过敏原标准化原则，包括主要过敏原生产和免疫特性的比较［7］。过敏原粗提液实现标准化的难度较大，成本昂贵，且对于疾病的诊断存在以下不足：①不同批次中过敏原组分不同；②不同批次中过敏原含量不确定；③粗提物中某种组分的过敏原浓度可能较低，无法与IgE 结合；④粗提物中除过敏成分外，包含了非过敏成分影响诊断；⑤无法判断哪种组分过敏，更无法判断哪些过敏原交叉过敏［8-11］。天然提取和纯化过敏原已被证实价格昂贵且技术难度大。

随着重组DNA 技术的发展，具有天然过敏原相同免疫学特性的重组过敏原被开发出来［6，12］。在获得第一个过敏原的DNA 序列后不久，有研究表明桦树花粉和草粉的重组过敏原可代替天然过敏原成分进行血清学IgE 诊断，其特异度和敏感度并不会降低［13-14］。虽然这超乎当时很多人的认知：当时认为过敏原分子具有不同表型，不可能找出适用于所有患者的同型过敏原［15-16］。随着重组过敏原的快速发展，组分分辨诊断（component-resolved diagnostics，CRD）的概念随之产生并进入临床。

组分分辨诊断的宗旨是在分子水平上明确过敏原，进一步了解过敏反应机制，为诊断和疗效评估提供有力证据。如桦树花粉过敏患者在食用某些水果和蔬菜后会出现口腔过敏症状，对这类患者而言，不同过敏原中可能含有导致交叉过敏的分子［17-18］。

1.2 过敏原芯片的开发与发展 为了更好地利用重组过敏原蛋白进行过敏性疾病的诊断，需要建立一个测试平台，可方便快捷、直观地绘制出过敏患者特异性IgE 反应谱。见图1。基于芯片技术的发展，其被用于过敏原检测芯片的开发，过敏原芯片上的分子保留完整的三级结构，可检测和定量分析血清特异性IgE 功能［19-20］。1999 年蛋白质芯片被推出［21］；2002 年MANFRED MÜLLER 等开发出了第一款用于过敏性疾病诊断的过敏原芯片，应用微阵列技术将90多种过敏原分子共价结合于固相载体，研究发现只需要极少数血清即可检测出IgE 反应性，这个突破性的发现改变了过敏性疾病诊断，此后过敏原芯片开始成为过敏性疾病诊断的重要辅助工具［20］。过敏原芯片是利用微阵列点样机将重组蛋白点样至固有载体，载体可以是玻璃材质的载玻片，也可以是纤维素膜。加入少量血清进行反应，使用全自动化扫描仪检测荧光强度来判断特异性IgE含量，实验流程参考文献［22］。

图1 过敏原芯片检测血清特异性IgE流程Fig.1 Principle of allergen microarray detection of serum specific IgE

迄今为止，市场上使用最广泛的过敏原芯片是ImmunoCAP ISAC（112 种过敏原）和MeDALL allergen-Chip（176 种过敏原），MeDALL allergen-Chip 由欧盟基金资助（European Union-funded），用于研究欧洲过敏和哮喘儿童血清特异性IgE和IgG反应，相较于ImmunoCAP ISAC 芯片增加了重要过敏原的数量，并提高了敏感度［23］。MADx Allergen Explorer ALEX 芯片上包含157 种过敏原提取物和125 种组分，共计282个过敏原［24］。

2 过敏原芯片在诊断中的应用

2.1 吸入性过敏原检测 ImmunoCAP ISAC（112种过敏原）检测461例有哮喘、鼻炎、结膜炎、气道高反应性等过敏史的儿童血清，数据表明尘螨、花粉和宠物过敏原与哮喘高度相关，芯片对吸入性过敏原诊断是可靠的［25］。ISAC-CRD89（VBC-Genomics， Phadia，Sweden）芯 片 和Advia-Centaur 法 检 测 对 120例花粉过敏患者血清进行特异性IgE 检测，比较两种方法的Kappa、Spearman rho、Wilcoxon，发现除Par j 1 外均具有高度相关性，组分分辨诊断在30%的诊断结果中起到了补充修正作用［26］。Immuno-CAP 和过敏原芯片（ISAC®version CRD-50，VBC- GENOMICS，Vienna， Austria）两种方法检测过敏性鼻结膜炎患者血清中尘螨、猫皮屑、桦树、草和艾蒿花粉的特异性IgE，受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）结果显示芯片可以替代ImmunoCAP 检测尘螨、猫皮屑、桦树、草特异性IgE，在检测猫皮屑、桦树花粉、草的敏感度与ImmunoCAP 相当，在检测尘螨和艾蒿花粉时敏感度稍低［27］。有研究检测123例过敏患者血清尘螨总IgE、Der p 1、Der p 2、Der p 10 的特异性IgE 和患者血清中的IgG4，同时使用ImmunoCAP ISAC（103 种过敏原）检测24 例患者的血清，检测阈值为0.3 ISU/ml，定性结果与ImmunoCAP完全一致，在Der p 1和Der p特异性IgE 检测结果中两者结果具有较好的相关性，在检测Der p 10 的特异性IgE 时，5 份血清用ISAC 法无法检测到低于0.41 kU/L 的免疫球蛋白，在这一方面ISAC 的敏感度较ImmunoCAP 低，但总体而言芯片在检测尘螨过敏原特异性IgE 方面可以替代ImmunoCAP［28］。

2.2 食物过敏原检测 ImmunoCAP ISAC 112 芯片对韩国41例有核桃过敏病史的儿童进行检测，其中32 例儿童临床诊断为核桃过敏，31 例患者血清有Jug r 1特异性IgE，揭示了核桃过敏原中的主要过敏原为Jug r 1，文章绘制了Jug r 1 特异性IgE、核桃特异性IgE和核桃粗提物特异性IgE间的ROC，并计算曲线下面积（AUC）。诊断幼儿核桃过敏和幼儿是否对核桃耐受，检测Jug r 1-sIgE（AUC=0.788）优于检测WN-sIgE（AUC=0.563）［29］。开发和设计一款时间分辨荧光（time-resolved fluorometric，TRF）芯片，上面包含牛奶、蛋清、大米、大豆、花生和小麦6种过敏原提取物，该芯片检测人血中IgE用量极少，是CAP/RAST FEIA 方法的1/15，但检测结果相关性较高［30］。同样可以制作过敏原多肽芯片，将牛奶中的酪蛋白αs1、酪蛋白s2、酪蛋白b、酪蛋白κ 和乳球蛋白b 的一级序列在芯片上分成多个多肽点，检测人血清中的特异性IgE 来判断抗原表位所在位置［31］。花生过敏原的抗原表位可采用相同方法检测［32］。

总之，过敏原芯片在疾病诊断方面具有明显优势，相对于传统过敏性疾病诊断方法，过敏原芯片基于组分分辨诊断概念，使用少量血清检测同一患者对多种过敏原单组分的IgE 结合率，可明确多种过敏原间的交叉反应和共致敏情况，判断出某种过敏原是否为主要过敏原，检测结果同ImmunoCAP 金标准具有很好的相关性，直观地了解每位患者的IgE 反应谱，为过敏性疾病诊断和后续特异性免疫治疗方案制定提供了有力证据。

3 过敏原芯片对特异性免疫治疗效果的 评估作用

3.1 过敏原芯片评估特异性免疫治疗效果原理 特异性免疫性治疗是唯一一种可以根除过敏性疾病的方法，通过注射或舌下含服等方式不停地给机体注入过敏原或过敏原修饰物，改变过敏反应进程、诱导过敏原保护性抗体，使机体逐渐适应过敏原而减少过敏时的反应［33-34］。特异性免疫治疗可治疗过敏性疾病的重要原因是诱导保护性抗体IgG 产生［35-37］。过敏原特异性IgG 可竞争性阻断过敏原与IgE 结合，使机体免疫机制发生改变，过敏反应减轻［38-40］。有研究表明母亲体内高浓度的IgG 可保护婴儿在出生后的4～5 年不对过敏原产生特异性IgE抗体［41-42］。患者血清中的特异性IgG 变化可评估特异性免疫治疗的效果［43］。

特异性免疫治疗的关键是确定真正过敏原和监测治疗效果以便随时调整治疗方案，前文已经介绍了芯片确定过敏原的优势，过敏原芯片同样可监测免疫治疗效果，能够检测特异性IgG。如何在实际临床中监测这种现象？选择含有大量过敏原的ImmunoCAP 一类的检测技术并不能模拟体内特异性IgG 阻止IgE 结合过敏原，只有在ImmunoCAP ISAC和MeDALL chip这类芯片上才能实现［44-46］。

3.2 过敏原芯片评估特异性免疫治疗效果的应用 使用含有178 种过敏原的MeDALL chip，对其中15种尘螨过敏原（Der p 1、Der f 1、Der p 2、Der f 2、Der p 4、Der p 5、Der p 7、Der p 10、Der p 11、Der p 14、Der p 15、Der p 18、Der p 21、Der p 23、Der p 37）进行研究，结果显示免疫治疗剂Alutard SQ 510可使机体产生针对Der p 1、Der p 2 的保护性免疫球蛋白，对Der p 1、Der p 2 患者的疗效较好［47］。使用BM32 草花粉过敏疫苗治疗2 年后，患者血清中IgG4反应增加，第2 年比第1 年的反应强烈，而第2 年的临床疗效高于第1年。以上研究表明过敏原芯片检测不仅可以帮助查找过敏原，还可用于治疗过程中监测血清IgG判断治疗效果［48］。增加24例草花粉过敏的过敏性鼻结膜炎患者的皮下免疫治疗药物，并检测加药前后的草花粉过敏原特异性IgE和IgG，ISAC检测免疫治疗加药后特异性IgE 明显下降，而IgG4在治疗12 周后从0 ISU 增加至0.83 ISU，在ImmunoCAP 测量的加药阶段，针对主要过敏原Phl p 1 和Phl p 5的特异性IgE水平从平均23.0 kU/L增至48.8 kU/L，ISAC 可用于监测过敏原特异性免疫疗法诱导的非IgE抗体的阻断效果［49］。

4 过敏原芯片的展望

过敏原芯片已被证实是过敏性疾病诊断的辅助工具，但因其昂贵的价格，未被广泛应用于临床，可以采取手段降低检测成本。过敏原芯片的材料主要有两种：玻璃和硝酸纤维素膜。ImmunoCAP ISAC 芯片使用玻璃材料，MADx Allergen Explorer ALEX芯片使用硝酸纤维素膜［20，50］。有研究表明，使用硅及表面材质可以替代玻璃，且优化过的硅基材料会产生更强的荧光，使过敏原芯片敏感性更高［51-52］。在硅芯片上检测牛奶和鸡蛋的过敏原蛋白特异性IgE 和IgG4，硅芯片上的荧光强度与ISAC 的半定量结果相比，大多数相关系数＞0.7，硅芯片测得鸡蛋特异性IgE 的与ImmunoCAP 结果相关性好，灵敏度低至0.35 kUA/L。对血清中特异性IgG4抗体的检测只能在低浓度下进行，但与ImmunoCAP 结果呈正相关［53］。以Bet v 1过敏原为例，将人单克隆嵌合IgE 抗体从208 ISU/ml 按倍比稀释到0.025 ISU/ml，检测玻璃材质和硅材质芯片上的IgE 反应率，结果显示在52～0.025 ISU/ml 范围内，硅芯片上的IgE 反应荧光强度比ISAC 高5 倍，硅芯片甚至允许测量浓度为0.025 ISU/ml的特异性IgE，而在国际上芯片的检测cut-off 值为0.3 ISU/ml，某些研究检测下限值是0.1 ISU/ml，硅材质芯片明显在灵敏度方面胜出。或者使用组合芯片进行过敏原诊断，根据临床情况选择单个的硅芯片组合出不同的过敏原芯片，这种设计可大大减少成本［54］。

5 结论

组分分辨诊断在过敏性疾病诊断中发挥重要作用，明确过敏原单组分可对过敏性疾病的诊断和疗效评估提供有力证据。过敏原芯片技术在20 年内快速发展，许多研究者对芯片进行了大量研究，研究表现了过敏原芯片高通量、方便、快捷、样本量小的优势，非常适用于儿科过敏患者，对于过敏性疾病的诊断和疗效评估方面表现出来极大优势，成为体外检测特异性IgE 抗体的重要工具。现有市售芯片均为国外产品，国内体外诊断行业迫切需要开发国产化过敏原芯片。