王立芹 陈红营 隋 英 贾荣军 沈 亮 （德州市人民医院儿科，德州 253000）

小儿哮喘是临床常见的一种疾病类型，由支气管上皮细胞损伤与功能障碍导致，在外界刺激性物质作用下支气管上皮细胞结构及功能被破坏而产生炎症因子，炎症因子大量释放与细胞凋亡数量增加是引起哮喘患儿支气管上皮细胞损伤的重要原因，目前人支气管上皮细胞损伤的分子机制尚未完全阐明［1-2］。研究表明长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在重症哮喘患者中表达异常，并可能参与哮喘的形成机制，还可调节支气管上皮细胞凋亡、炎症等生物学过程［3-4］。lncRNA OIP5-AS1在屋尘螨诱导的人支气管上皮细胞中表达升高， 并可通过miR-143-3p/HMGB1 轴促进屋尘螨诱导 的人支气管上皮细胞炎症反应［5］。本研究通过生物信息学预测发现OIP5-AS1 与miR-7-5p 存在结合位点。本研究采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导人支气管上皮细胞建立细胞损伤模型，探讨OIP5-AS1/miR-7-5p 分子轴在人支气管上皮细胞损伤发生过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人支气管上皮细胞16HBE 购自武汉普诺赛生命科技有限公司；LPS 购自美国Sigma 公司；凋亡试剂购自江苏凯基生物技术股份有限公司； Lipofectamine2000 购自美国Invitrogen 公司；si-NC、si-OIP5-AS1、miR-NC、miR-7-5p mimics、anti-miRNC、anti-miR-7-5p 购自广州锐博生物科技有限公司；Trizol 试剂购自北京全式金生物；反转录与荧光定量检测试剂购自北京天根；IL-6、IL-8 检测试剂盒购自美国R&D；MTT 试剂购自上海信帆生物；一抗购自美国Santa Cruz；二抗购自美国Abcam。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 16HBE 细胞接种于含100 ng/ml LPS 的培养液内培养24 h，设为LPS 组［6］。同时将正常培养的16HBE 细胞设为Con 组。分别将si-NC、 si-OIP5-AS1、miR-NC、miR-7-5p mimics、si-OIP5-AS1与anti-miR-NC、si-OIP5-AS1 与anti-miR-7-5p 转染至16HBE 细胞后加入含100 ng/ml LPS 的培养液内培养24 h，分别设为LPS+si-NC组、LPS+si-OIP5-AS1组、LPS+miR-NC 组、LPS+miR-7-5p 组、LPS+si-OIP5-AS1+anti-miR-NC组、LPS+si-OIP5-AS1+anti-miR-7-5p组。

1.2.2 qRT-PCR 检测细胞中OIP5-AS1、miR-7-5p表达水平 采用Trizol 法提取各组16HBE 细胞总RNA 后检测其浓度，按照反转录试剂盒说明书将RNA 逆转录合成cDNA，根据荧光定量PCR 试剂盒说明书检测OIP5-AS1、miR-7-5p相对表达量。

1.2.3 ELISA 法检测IL-6、IL-8 水平 收集各组细胞培养上清液，采用ELISA 试剂盒检测IL-6、IL-8 的表达水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.4 MTT 检测细胞增殖 收集各组16HBE 细胞接种于96 孔板（100 µl/孔），每孔加入20 µl MTT 溶液，继续培养4 h 后弃上清，每孔加入150 µl DMSO，室温避光振荡孵育5 min后检测OD值。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集各组16HBE 细胞加入预冷PBS 洗涤后弃上清，向细胞沉淀中加入500 µl 结合缓冲液，按照凋亡试剂盒说明书检测细胞凋亡率。

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测OIP5-AS1与miR-7-5p 的靶向关系 构建含结合位点的野生型载体WT-OIP5-AS1 与含突变位点的突变型载体MUTOIP5-AS1，miR-NC、miR-7-5p mimics 分 别 与WTOIP5-AS1、MUT-OIP5-AS1 共转染至16HBE 细胞后继续培养48 h，收集细胞，检测荧光素酶活性。

1.2.7 Western blot 检测Bcl-2、Bax 蛋白表达 提取各组16HBE 细胞总蛋白，SDS-PAGE 分离蛋白，转膜后室温封闭2 h，加入一抗稀释液（1∶1 000） 4 ℃ 孵育过夜，加入二抗稀释液（1∶2 000）室温孵育1 h，应用Image J软件分析各条带灰度值。

1.3 统计学处理 应用SPSS21.0统计学软件分析数据，计量资料以±s表示且均符合正态分布，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS 诱导的人支气管上皮细胞中OIP5-AS1 与miR-7-5p 表达量 与Con 组相比，LPS 组OIP5-AS1表达水平升高（P＜0.05），miR-7-5p 表达水平降低 （P＜0.05，表1）。

表1 LPS 诱导 的16HBE 细胞中OIP5-AS1 与miR-7-5p 的表达（±s，n=9）Tab.1 Expressions of OIP5-AS1 and miR-7-5p in 16HBE cells induced by LPS （±s，n=9）

表1 LPS 诱导 的16HBE 细胞中OIP5-AS1 与miR-7-5p 的表达（±s，n=9）Tab.1 Expressions of OIP5-AS1 and miR-7-5p in 16HBE cells induced by LPS （±s，n=9）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05.

2.2 干扰OIP5-AS1 对LPS 诱导的人支气管上皮细胞炎症损伤的影响 与Con 组相比，LPS 组IL-6、 IL-8水平升高（P＜0.05）；与LPS+si-NC组相比，LPS+si-OIP5-AS1组IL-6、IL-8水平降低（P＜0.05，表2）。

表2 干扰OIP5-AS1对LPS诱导的16HBE细胞炎症损伤的影响（±s，n=9，pg/ml）Tab.2 Effect of OIP5-AS1 interference on LPS-induced inflammatory injury of 16HBE cells（±s，n=9， pg/ml）

表2 干扰OIP5-AS1对LPS诱导的16HBE细胞炎症损伤的影响（±s，n=9，pg/ml）Tab.2 Effect of OIP5-AS1 interference on LPS-induced inflammatory injury of 16HBE cells（±s，n=9， pg/ml）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with LPS+si-NC group， 2）P＜0.05.

2.3 干扰OIP5-AS1 对LPS 诱导的人支气管上皮细胞增殖及凋亡的影响 与Con 组相比，LPS 组细胞活力降低，凋亡率升高，Bax 蛋白水平升高，Bcl-2 蛋白水平降低（P均＜0.05）；与LPS+si-NC 组相比，LPS+si-OIP5-AS1组细胞活力升高，凋亡率降低，Bax蛋白水平降低，Bcl-2 蛋白水平升高（P均＜0.05， 图1、表3）。

表3 干扰OIP5-AS1对LPS诱导的16HBE细胞增殖及凋亡的影响（±s，n=9）Tab.3 Effect of OIP5-AS1 interference on proliferation and apoptosis of 16HBE cells induced by LPS （±s，n=9）

表3 干扰OIP5-AS1对LPS诱导的16HBE细胞增殖及凋亡的影响（±s，n=9）Tab.3 Effect of OIP5-AS1 interference on proliferation and apoptosis of 16HBE cells induced by LPS （±s，n=9）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with LPS+si-NC group， 2）P＜0.05.

图1 干扰OIP5-AS1对LPS诱导的16HBE细胞凋亡的影响Fig.1 Effect of interference with OIP5-AS1 on 16HBE cell apoptosis induced by LPS

2.4 OIP5-AS1 靶向调控miR-7-5p starBase 预测结果显示OIP5-AS1与miR-7-5p存在结合位点（图2）。miR-7-5p 过表达可明显降低野生型载体WT-OIP5-AS1 的荧光素酶活性（P＜0.05），而对突变型载体MUT-OIP5-AS1 的荧光素酶活性无明显影响（表4）。与si-NC 组相比，si-OIP5-AS1 组miR-7-5p 表达水平升高（P＜0.05，表5）。

表4 双荧光素酶报告基因实验（±s，n=9）Tab.4 Double luciferase reporter gene experiment （±s， n=9）

表4 双荧光素酶报告基因实验（±s，n=9）Tab.4 Double luciferase reporter gene experiment （±s， n=9）

Note：Compared with miR-NC group， 1）P＜0.05.

表5 OIP5-AS1靶向调控miR-7-5p表达（±s，n=9）Tab.5 OIP5-AS1 could target and regulate expression of miR-7-5p （±s，n=9）

表5 OIP5-AS1靶向调控miR-7-5p表达（±s，n=9）Tab.5 OIP5-AS1 could target and regulate expression of miR-7-5p （±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group， 1）P＜0.05.

图2 OIP5-AS1序列中含有与miR-7-5p互补的核苷酸序列Fig.2 Sequence of OIP5-AS1 contains a nucleotide sequence complementary to miR-7-5p

2.5 miR-7-5p 过表达对LPS 诱导的人支气管上皮细胞炎症、增殖及凋亡的影响 与LPS+miR-NC 组相比，LPS+miR-7-5p 组IL-6、IL-8 水平降低，细胞活力升高，凋亡率降低，Bax 蛋白水平降低，Bcl-2 蛋白水平升高（P均＜0.05），见图3、表6。

表6 miR-7-5p过表达对LPS诱导的16HBE细胞炎症、增殖及凋亡的影响（±s，n=9）Tab.6 Effects of miR-7-5p overexpression on LPS-induced inflammation， proliferation and apoptosis of 16HBE cells （±s，n=9）

表6 miR-7-5p过表达对LPS诱导的16HBE细胞炎症、增殖及凋亡的影响（±s，n=9）Tab.6 Effects of miR-7-5p overexpression on LPS-induced inflammation， proliferation and apoptosis of 16HBE cells （±s，n=9）

Note：Compared with LPS+miR-NC group， 1）P＜0.05.

图3 miR-7-5p 过表达对LPS 诱导的16HBE 细胞凋亡的 影响Fig.3 Effect of miR-7-5p overexpression on LPS-induced apoptosis of 16HBE cells

2.6 抑制miR-7-5p 表达可逆转干扰OIP5-AS1 对LPS 诱导的人支气管上皮细胞炎症、增殖及凋亡的影响 与LPS+si-OIP5-AS1+anti-miR-NC 组相比，LPS+si-OIP5-AS1+anti-miR-7-5p 组IL-6、IL-8 水平升高，细胞活力降低，凋亡率升高，Bax 蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低（P均＜0.05），见图4、表7。

图4 抑制miR-7-5p 表达可逆转干扰OIP5-AS1 对LPS 诱导的16HBE细胞凋亡的影响Fig.4 Inhibition of miR-7-5p expression could reverse effect of interfering with OIP5-AS1 on LPS-induced apoptosis of 16HBE cells

表7 抑制miR-7-5p表达可逆转干扰OIP5-AS1对LPS诱导的16HBE细胞炎症、增殖及凋亡的影响（±s，n=9）Tab.7 Inhibition of miR-7-5p expression could reverse effect of interfering with OIP5-AS1 on LPS-induced inflammation， proliferation and apoptosis of 16HBE cells （±s，n=9）

表7 抑制miR-7-5p表达可逆转干扰OIP5-AS1对LPS诱导的16HBE细胞炎症、增殖及凋亡的影响（±s，n=9）Tab.7 Inhibition of miR-7-5p expression could reverse effect of interfering with OIP5-AS1 on LPS-induced inflammation， proliferation and apoptosis of 16HBE cells （±s，n=9）

Note：Compared with LPS+si-OIP5-AS1+anti-miR-NC group，1）P＜0.05.

3 讨论

lncRNA 在支气管上皮细胞损伤中表达异常并可发挥调控作用［6-8］。已有多篇文献报道OIP5-AS1在ox-LDL 诱导的内皮细胞损伤中发挥重要作用［9-11］。但OIP5-AS1 在LPS 诱导的支气管上皮细胞损伤中的表达尚未可知。本研究结果显示，LPS 诱导的16HBE 细胞中OIP5-AS1 表达水平升高。本研究发现LPS 诱导的16HBE 细胞中IL-6、IL-8 水平升高，与既往研究结果相似，提示支气管上皮细胞损伤模型成功建立［12］。此外，干扰OIP5-AS1表达可明显降低IL-6、IL-8 水平，提示干扰OIP5-AS1 表达可抑制LPS诱导的支气管上皮细胞炎症反应。本研究结果显示，LPS诱导的16HBE细胞活力降低，凋亡率升高，而干扰OIP5-AS1 表达可明显增强LPS 诱导的16HBE 细胞活力，降低凋亡率，Bax 蛋白水平降低，Bcl-2 蛋白水平升高，提示干扰OIP5-AS1 表达可促进LPS诱导的16HBE细胞增殖而抑制细胞凋亡。

本研究证实OIP5-AS1 可靶向结合miR-7-5p，并负向调控miR-7-5p 活性。此外，研究发现LPS 诱导的16HBE 细胞中miR-7-5p 表达水平降低，干扰OIP5-AS1 表达可明显提高miR-7-5p 的表达水平。lncRNA ANRIL 通过靶向miR-7-5p/SIRT1 轴而减轻缺氧诱导的心肌细胞损伤［13］。本研究结果显示，miR-7-5p 过表达可明显降低IL-6、IL-8 水平，细胞活力升高，凋亡率降低。同时本研究采用抑制miR-7-5p表达与干扰OIP5-AS1 表达联合处理LPS 诱导的16HBE 细胞，结果显示IL-6、IL-8 水平升高，细胞活力降低，凋亡率升高，提示抑制miR-7-5p 表达可逆转干扰OIP5-AS1 对LPS 诱导的人支气管上皮细胞炎症、增殖及凋亡的作用。

综上所述，支气管上皮细胞损伤模型中OIP5-AS1表达水平升高，而miR-7-5p表达水平降低，干扰OIP5-AS1 表达可通过上调miR-7-5p 表达抑制LPS诱导的支气管上皮细胞炎症反应、凋亡及促进细胞增殖，从而减轻细胞损伤，OIP5-AS1 可能通过靶向调控miR-7-5p 参与哮喘等呼吸道疾病的发生及发展过程，但其具体作用机制尚需进一步探究。