韩翠萍，段佳玉，曹 晨，李 戈，杨 雪，江连洲，于殿宇

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

玉米分布极为广泛，成为世界第3大粮食作物，含有丰富的营养物质，可以为人体提供能量，提高新陈代谢，调节人体神经系统[1]。近几年我国玉米产量不断增加，2021年总产量达2.72亿 t[2]，但我国玉米的利用率较低，利用方式单一，玉米深加工工业仍存在加工规模小、深加工产业链条短等问题。因此，提高玉米的利用率及经济价值，加快玉米工业化的转化速度，具有重要意义。

随着微生物技术的发展，发酵技术也被后人不断创新、发扬。食品发酵过程中，微生物犹如“灵魂”般的存在，是发酵成败的关键，微生物在发酵过程中主要通过水解已有的化合物产生新的化合物[3]，通过降解复杂化合物，达到改善感官品质和提高营养价值的目的。Decimo等[4]研究植物乳杆菌发酵对玉米麸皮的影响，结果表明，可溶性膳食纤维显著增加，植酸下降，有利于人体对重要矿物质元素的吸收。Daria[5]将糖化与酿酒酵母发酵玉米粉同步进行，结果发现，经过发酵后的玉米粉保水性和黏弹性显著增强。Khan等[6]对比酿酒酵母菌单一发酵和加入乳酸菌共发酵对膨化糙米糖化溶液抗氧化性的影响，研究发现，发酵后的溶液抗氧化性更强，酿酒酵母菌和乳酸菌共发酵还能提高肉桂酸、山柰酚等抗氧化活性物的含量，说明共培养能明显改善膨化糙米的加工特性。但是对于应用植物乳杆菌、酿酒酵母菌及二者复配发酵对玉米粉品质和风味的对比研究鲜见报道。

本研究以未发酵玉米粉为对照，对自然发酵、植物乳杆菌、酿酒酵母菌及复配菌种（植物乳杆菌和酿酒酵母菌）发酵制得的玉米粉品质进行分析，综合比较玉米粉的糊化特性、微观结构、营养成分、风味以及发酵效率确定最佳发酵方式，以此改善玉米粉的品质，提高玉米的利用率，旨在为发酵玉米粉的菌种选择和发酵玉米粉在食品中的进一步应用提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米碴品种为先玉335；植物乳杆菌菌粉 郑州宇控生物科技有限公司；酿酒酵母菌菌粉 安琪酵母股份有限公司；硫酸、氢氧化钠、盐酸、乙醇、对硝基苯酚、考马斯亮蓝G-250 天津市天力化学试剂有限公司；硫酸铜 上海源叶生物科技有限公司；牛血清白蛋白 北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DHG-9240A电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；V-5000可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；ARRW60型电子精密天平 奥豪斯仪器（上海）有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 攻义市英峪高科仪器厂；Hitachi SU-8010钨丝灯扫描电子显微镜 日本Hitachi公司；PEN3电子鼻 德国Airsense公司；RVA-Super3-型快速黏度分仪 澳大利亚新港科学仪器公司；PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米粉发酵工艺

以玉米碴为原料进行发酵，工艺流程如下：

根据前期实验结果，以玉米粉的溶解度和膨胀势为指标，获得不同发酵方式最佳条件为：自然发酵：25 ℃，13 d；植物乳杆菌发酵：35 ℃，72 h，10%；酿酒酵母菌发酵：35 ℃，18 h，4%；复配菌种发酵：28 ℃，48 h，6%，1∶1。以此发酵制得的玉米粉为处理组，以未发酵玉米粉为对照组，对比不同发酵方式对玉米粉品质和风味的影响。

1.3.2 发酵液pH值及可滴定酸度的测定

按照参照文献[7]的方法。取适量发酵液，用pH计测定pH值，酸碱滴定法测定可滴定酸度。

1.3.3 糊化特性的测定

称取玉米粉样品3.50 g，与25 mL蒸馏水一并倒入RVA测试罐中，搅拌至无结块状态后，安装测试罐和浆叶进行测定。程序设定为：起始温度50 ℃，持续1 min，再以12 ℃/min速率升温至95 ℃，保持2.5 min，再以12 ℃/min速率降温至50 ℃，保持2 min，测定过程总计13 min。

1.3.4 微观结构的测定

将少许玉米粉固定于样品载体片上，放置于钨灯丝扫描电子显微镜下拍摄有代表性的颗粒形貌。观察时放大倍率为3500 倍和5000 倍，压力5.00 kV。

1.3.5 营养成分的测定

水分含量：参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》直接干燥法；粗蛋白质含量：参照考马斯亮蓝比色法[8]；粗脂肪含量：参照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》酸水解法；粗灰分含量：参照GB 5009.4—2016《食品中灰分的测定》干法灰化；粗纤维含量：参照GB/T 5515—2008《粮油检验 粮食中粗纤维素含量测定》介质过滤法；淀粉含量：参照GB 5009.9—2016《食品中淀粉的测定》酶水解法。

1.3.6 风味分析

参照文献[9]的方法用电子鼻测定。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 发酵方式对玉米发酵液pH值和可滴定酸度的影响

如图1所示，随着发酵时间的延长，4 种发酵方式的发酵液pH值呈下降趋势，可滴定酸度呈上升趋势。

图1 发酵过程中发酵液的pH值和可滴定酸度的变化Fig.1 Changes in pH and titratable acidity of fermentation broth during fermentation process

自然发酵前期0～8 d，pH值下降和可滴定酸度升高比较明显，此时发酵液中的乳酸菌可能成为优势菌群，乳酸菌活力较强，但是相比菌种发酵而言，其发酵液内优势菌菌落数较少，会与杂菌争夺营养物质，发酵周期相对较长。发酵8～13 d，发酵液的pH值和可滴定酸度趋于稳定，此时的优势菌群为乳酸菌和酵母菌[10]，两种菌可以互相利用产生次代谢产物，使发酵环境达到平衡。随着发酵时间的延长，发酵液的pH值逐渐上升，可滴定酸度逐渐下降，发酵液也逐渐开始变浑浊，出现酸臭味。

植物乳杆菌发酵前期0～72 h，pH值从5.34降至3.36，可滴定酸度从0.07%上升至3.64%，该阶段营养丰富，植物乳杆菌活力强，菌落数量多且是发酵液内唯一的优势菌，繁殖加快，产酸量较大。72 h后pH值和可滴定酸度逐渐趋于平稳。发酵后期，pH值开始回升，可滴定酸度呈下降趋势，说明植物乳杆菌的产酸能力逐渐降低。

酿酒酵母菌在发酵前期0～12 h，pH值下降和可滴定酸度上升相对较快，说明酿酒酵母能够利用玉米中的营养物质，并且产生部分酸性物质；发酵后期pH值有回升现象，可滴定酸度也开始下降，可能是酿酒酵母菌生长需要消耗糖，随着糖含量的减少，酿酒酵母菌开始利用乙酸与钠离子结合生成乙酸钠，与此同时也会利用氨基酸的羧基，导致羟基相对较多，造成酸含量下降[11]。

复配菌种发酵前期0～12 h，pH值下降速度和可滴定酸度上升速度相对缓慢，酿酒酵母菌优先利用营养物质，对植物乳杆菌产酸稍有抑制。有研究表示，酵母菌与乳酸菌的共存体系中存在适应反应机制，如果这种机制被激活，两种菌会产生“交叉保护”的现象，随着发酵时间的推进，两种菌的活力并没有降低，而是互相利用，达到稳定共生的平衡体系[12]，产酸量增大，pH值下降和可滴定酸度上升趋势加快，相比自然发酵，复配菌种代谢活跃，几乎不与其他杂菌产生种内竞争。60 h后，两种菌的活力逐渐下降，营养物质越来越少，因此走向自溶或衰亡。

2.2 发酵方式对玉米粉糊化特性的影响

图2结合表1可知，发酵后的玉米粉糊化温度和峰值时间显著增高（P＜0.05）。复配菌种发酵的玉米粉糊化温度达到73.6 ℃，显著高于自然发酵（72.3 ℃）、植物乳杆菌（73 ℃）和酿酒酵母菌发酵的玉米粉（73 ℃）（P＜0.05），说明在发酵过程中，总淀粉含量增加，淀粉分子结构降解，直链淀粉含量的增加，使淀粉分子之间相互作用增加，分子间有序性提高，支链淀粉的增加使玉米粉不易糊化[13]。玉米粉峰值黏度和最终黏度经过发酵后显著降低（P＜0.05），经过自然发酵、植物乳杆菌、酿酒酵母菌和复配菌种发酵后，玉米粉的峰值黏度分别降低了27%、22.8%、7.7%和26.4%。植物乳杆菌和复配菌种发酵的玉米粉的保持黏度显著低于未发酵、自然发酵和酿酒酵母菌发酵的玉米粉（P＜0.05），可能这两种发酵方式产乳酸量较大，破坏了淀粉无定形区域的结构，使淀粉增强了与水的结合能力[14]。

图2 玉米粉的RVA糊化曲线Fig.2 RVA pasting curves of maize flour

表1 玉米粉的糊化特征值分析Table 1 Pasting characteristics of maize flour

衰减值反映淀粉在加热过程中的稳定性，衰减值越小，淀粉颗粒稳定性越好，加热搅拌时越不容易被破坏[15]。回生值反映的是淀粉糊化后老化回生的速度，淀粉的回生值越高，越容易老化[16]。未发酵玉米粉衰减值为2254 cP，回生值为2253 cP，发酵后对玉米粉衰减值和回生值均显著下降（P＜0.05）。自然发酵和复配菌种发酵的玉米粉衰减值分别降低了45.7%和45%，同样，经过这两种发酵后的玉米粉回生值分别降低了40%和37.4%，说明经过自然发酵和复配菌种发酵后的玉米粉稳定性和抗老化性能得到进一步提高。

2.3 发酵方式对玉米粉微观结构的影响

将玉米粉颗粒放大3500 倍可见，发酵后的玉米粉颗粒表面破坏性较大，类似侵蚀的痕迹较明显。相比来说，未发酵玉米粉颗粒（图3A1）较大，复配菌种发酵后的玉米颗粒（图3E1）相对较小，主要是由于发酵过程中无定形区域和部分结晶区域水解造成的[17]。图3B2和图3D2分别是经过自然发酵和酿酒酵母菌发酵后的玉米粉颗粒，颗粒表面出现许多大小不同的孔洞，因为发酵过程中会产生许多蛋白酶，经过酶水解，致使淀粉和蛋白分离[18]。将颗粒放大5000 倍可见，经植物乳杆菌发酵过后的玉米粉颗粒，颗粒的结构较松散（图3C2），发酵过程中蛋白质和脂肪被降解，致密表面结构被破坏，形成空心骨架，表面积增加，有利于吸收其他化合物[19]。复配菌种发酵后的玉米粉颗粒，表面结构破坏最严重（图3E2），由于发酵过程中植物乳杆菌和酿酒酵母菌的协同作用，营养物质被降解的同时，分子链也受到严重破坏，使支链淀粉中短链含量增加，导致分子链之间的高度松散[20]，这有助于提高玉米粉的理化性质和功能特性。

图3 玉米粉微观结构Fig.3 Microstructure of maize flour

2.4 发酵方式对玉米粉营养成分的影响

发酵是食品中的重要加工技术，不但可以提高感官品质，还可以减少病原微生物，增强食品的营养价值，满足人类的需求[21]。结合表2可知，发酵前后玉米粉的水分含量均无显著差异。经过发酵后的玉米粉粗蛋白含量显著降低（P＜0.05），可能是乳酸中的α-羟基结构与多肽链上的基团相互作用，形成氢键，促进蛋白的溶出[22]，经酿酒酵母菌和复配菌种发酵的玉米粉粗蛋白含量下降幅度较大，分别降低了4.9%和5.98%。原因主要分为以下两方面：一方面因为这两种发酵方式在发酵过程中不但产生乳酸，酿酒酵母菌还会产生有机酸，通过三羧酸循环参与酶反应，可以加速蛋白酶的产生，从而加速蛋白的降解[23]，另一方面，蛋白质在水解过程中会产生游离氨基酸和多肽，这是微生物生长和植物乳杆菌产有机酸所必需的[24]，因此复配菌种发酵对粗蛋白的影响最大，同样，脂肪在发酵过程中也被产生的脂肪氧化酶降解[25]。发酵后的玉米粉粗脂肪含量显著下降（P＜0.05），复配菌种发酵的玉米粉粗脂肪含量降低了1.32%。由于发酵过程中蛋白质和脂肪被降解，所以包裹在其中的矿物质也被释放出来，而且在植物乳杆菌发酵过程中也会产生葡萄糖苷酶，对粗纤维有降解作用[26]，发酵后的玉米粉粗灰分和粗纤维均显著降低（P＜0.05）。同时发酵过程中支链淀粉结构相对疏松，会优先被利用，支链淀粉质量分数相对会有所下降，但是随着发酵过程中微生物对营养物质的消耗以及产生的蛋白酶和脂肪酶的作用，蛋白质和脂肪被降解，包裹在蛋白质和脂肪中的淀粉被释放出来[27]。

表2 玉米粉中主要营养成分质量分数Table 2 Content of major nutrients in maize flour before and after fermentation%

2.5 发酵方式对玉米粉风味特性的影响

主成分分析（principal component analysis，PCA）累计贡献率主要反映样品的信息，贡献率越大，信息越清晰；不同样品所对应的横纵坐标距离表示不同样品间的风味差异，距离越大，风味差异越大[28]。电子鼻PCA如图4所示，PC1贡献率为93.44%，PC2贡献率为5.38%，总贡献率为98.82%，说明2 个PC能够反映指标的信息。5 种玉米粉样品在图中分布相对比较明显，其中未发酵玉米粉样品与植物乳杆菌发酵玉米粉重合较多，说明二者挥发性成分相差不大，由于发酵过程水解了玉米粉中的有机物复合大分子，部分芳香类有机物被释放，但是又流失了一部分游离态芳香类有机物，而且发酵过程中会有部分有机物相互抵消，所以产品风味的变化相似[29]。植物乳杆菌、酿酒酵母菌和复配菌种发酵玉米粉之间距离较远，说明三者的挥发性物质差异较大，自然发酵和其他3种发酵方式都有小部分重合，因为植物乳杆菌和酿酒酵母菌都存在于自然发酵的过程中，有些挥发性物质也是由它们产生的，所以挥发性物质会有重合的部分。总体看来，电子鼻PCA可以明显对未发酵及不同发酵方式的玉米粉进行区分。

图4 玉米粉的挥发性风味物质PCAFig.4 PCA plot of volatile flavor substances in maize flour

利用电子鼻的10 个传感器鉴定5 种不同玉米粉中的挥发性成分（图5）。未发酵玉米粉样品中，W6S、W5C、W1S传感器相对敏感，表明样品中氢化物、烷烃和芳香类物质相对较多。经过发酵后，W3C、W1S、W2S传感器数据均有明显增加，说明发酵对芳香类物质、烷烃和醇类物质影响较大。由于酿酒酵母菌在发酵过程中会产生酒精，增加玉米粉醇类化合物的产生，醇类会赋予发酵产物不同的芳香，例如酒香、果香等[30]，所以W2S和W3C所对应的传感器响应值较强。植物乳杆菌是自然发酵玉米粉中的优势菌群，单菌发酵过程中，由于缺少其他菌种的协同作用，所以与自然发酵相比，响应值差异不明显。经过复配菌种发酵制得的玉米粉相比其他3 种方式发酵粉，W1C、W5S、W1S传感器对其较敏感，响应值增加较多，说明经植物乳杆菌和酿酒酵母菌复配发酵的玉米粉可以更好提高芳烃化合物、氮氧化合物和醇类物质的挥发，同时，由于植物乳杆菌和酿酒酵母菌的协同作用，发酵过程中会产生更多有机酸、多糖和酶等物质，使玉米粉带有淡淡水果香气[31]。W2W传感器对有机硫化物较灵敏，大多硫化物对样品的气味会产生消极影响，例如臭鸡蛋味，经过酿酒酵母菌和复配菌种发酵后，传感器响应值降低。

图5 玉米粉的挥发性风味物质分析Fig.5 Analysis of volatile flavor substances in maize flour

3 结论

利用植物乳杆菌和酿酒酵母菌复配发酵玉米粉，发酵后的玉米粉糊化温度显著升高（P＜0.05），衰减值和回生值显著降低（P＜0.05），经复配菌种发酵后制得的玉米粉衰减值和回生值降幅最大，分别降低了45%和37.4%；发酵前后水分含量差异不显著，其他成分均显著下降（P＜0.05），总淀粉含量显著上升（P＜0.05），粗蛋白、粗脂肪等在发酵过程中被降解，其中植物乳杆菌和复配菌种发酵对玉米粉表面破坏较严重，改变了玉米粉的结构；酿酒酵母菌和复配菌种发酵产生的香气及代谢产物有效改善了发酵玉米粉的不良气味。植物乳杆菌、酿酒酵母菌和复配菌种发酵可以将玉米粉自然发酵所需的13 d分别缩短至72、18 h和48 h，有效提高了生产效率。经复配菌种发酵后制得品质、风味且加工性能更加优良的玉米粉。此研究为玉米粉的品质改善与应用、提高玉米的加工利用率以及发酵玉米粉的菌种选择提供了理论依据和技术支持。